Применение методов биотехнологии в безвирусном семеноводстве картофеля

Оригинальные статьи / Originalarticles

К ачество семенного материала картофеля является одним из главных факторов, определяющих его урожайность. Распространенность инфекционных болезней вирусной природы в агроценозах приобретает все более широкий масштаб. Освобождение семенного картофеля от вирусной и бактериальной инфекций, а также от других болезней, сохранение высокопродуктивных качеств сортов обеспечивается системой безвирусного семеноводства картофеля. Основная её задача – это оздоровление и ускоренное размножение безвирусного материала с последующим включением в процесс репродуцирования [1].

Для обеспечения стабильного объема потребления картофеля в стране, в рамках реализации утвержденной Правительством Подпрограммы «Развитие селекции и семеноводства картофеля в Российской Федерации» предусматривается повышение урожайности картофеля за счет создания и быстрого продвижения новых высоко- продуктивных сортов в производство на основе современных эффективных технологий выращивания качественного семенного материала [2, 3].

На Дальнем Востоке пораженность картофеля вирусами отмечается в большинстве областей и краев региона, этому способствуют специфические погодные условия, изобилие различных насекомых – переносчиков [4]. Вирусные болезни обусловливают снижение урожайности, ухудшается качество клубней. На юге Приморского края более 40 лет ведется мониторинг основных фитопа-тогенных вирусов и вирусоподобных организмов на картофеле. Многолетняя оценка фитосанитарного состояния показала, что на рядовых посевах картофеля во многих хозяйствах распространен комплекс вирусов, вироидов и фитоплазм, который влияет на качество, товарный вид и урожайность этой культуры. Последние десятилетние наблюдения показали, что наибольшее распространение имеет S-вирус картофеля (SВК). Достаточно велик уровень зараженности Y-вирусом картофеля (YВК), причем наблюдается значительное разнообразие штаммов. Процент зараженности вирусными заболеваниями в рядовых посевах картофеля колеблется в разные годы. Некоторые сорта могут служить резервуаром комплекса вирусных инфекций для окружающих посадок картофеля. Степень зараженности зависит от посадочного материала и может варьировать от 10-30% [5, 6]. Проблема усугубляется тем, что в настоящее время более 80% картофеля производится в личных подсобных хозяйствах, что усложняет возможность применения агротехнических приемов с элементами защиты растений от болезней и вредителей. В связи с этим крайне важно для Дальневосточного региона усовершенствовать процесс производства оригинальных семян на безвирусной основе и вести семеноводство с элементами оздоровления исходного материала.

Получение качественного исходного материала картофеля включает процесс освобождения сортов картофеля от вирусной инфекции с применением методов биотехнологии [7-9]. Зарубежные и отечественные коллеги рекомендуют использовать при оздоровлении картофеля биохимический метод с применением рибавирина [10-12].

В настоящее время в качестве способов оздоровления растений от вирусов используют различные методы терапии: культуры апикальных меристем, термотерапию, химиотерапию, криотерапию, электротерапию, а также комплексную (комбинированную) терапию, включающую комбинацию приемов различных методов. При проведении исследований, основанных на методах культуры апикальных меристем и криотерапии выявлена их эффективность в отношении вирусов PVY, PVA, PVM, однако в случае множественной инфекции необходимо комбинировать элементы различных протоколов оздоровления для повышения эффективности процедуры оздоровления [13].

Термотерапия in vivo и in vitro растений основана на снижении титра вирусов в зараженных тканях вследствие нарушения синтеза вирусных РНК при повышенных температурах - 36...40 С [14]. Способ менее эффективен в отношении сферических вирусов, поэтому при смешанных инфекциях его рекомендуют сочетать с другими технологиями [15].

Метод апикальных меристем в сочетании с химиотерапией позволяет оздоровить от вирусной инфекции растения регенеранты в культуре in vitro , полученные при оздоровлении методом апикальной меристемы в сочетании с термотерапией и имеющих положительную реакцию на вирусы по результатам ИФА, а также меристем, взятых с клубня растения, пораженного вирусами в латентной форме [16,17].

Метод электротерапии основан на пропускании электрического тока через растительные ткани, в результате чего происходит деградация вирусного нуклеопротеина и патоген утрачивает вирулентность [18, 19].

В Дальневосточном регионе в 2021 г. организован селекционно-семеноводческий центр по картофелю на базе ФГБНУ «ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки» в целях создания новых конкурентоспособных сортов, оздоровления их и включения в семеноводческий процесс.

В связи с этим исследования по этим направлениям имеют актуальность и первостепенное значение в развитии картофелеводства Дальнего Востока.

Цель исследований – разработать схему оздоровления картофеля с использованием методов биотехнологии и внедрить безвирусный материал в схему семеноводства.

Материал и методы

В качестве объекта исследования был взят перспективный сорт картофеля Моряк (селекционный номер При-08-11-1), полученный в ФГБНУ «ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки». Сорт среднеспелый с физиологической спелостью (от посадки до уборки) 98107 дней, столового назначения. Средняя урожайность – 34,1 т/га, потенциальная – 40,1 т/га. Содержание сухого вещества – 18,13-23,85%, крахмала – 12,10-17,24%, витамина С – 17,46-23,12 мг/100 г. Обладает устойчивостью к переувлажнению почвы, характеризуется высокой лежко-способностью (92,2-94,4%).

Испытание клубневых репродукций сеянцев и сортоиспытание гибридов проводили в полевых условиях в селекционно-семеноводческом севообороте в с. Пуциловка Уссурийского района Приморского края. Картофель выращивали в соответствии с принятой для Приморского края технологией [20].

В эксперименте исходный материал клубней отбирался в полевых условиях из внешне здоровых кустов. Требования, предъявляемые к материалу, намеченному к отбору: растение – типичное по морфологическому строению для данного сорта, абсолютно здоровое по внешнему виду, нормально развитое, с характерным для сорта количеством стеблей. Клубни – типичные по морфологическим признакам для данного сорта без признаков веретеновид-ности, здоровые, по визуальной оценке [7, 21].

Оздоровление сортообразцов картофеля и выявление скрытых вирусных инфекций. В процессе оздоровления сорта Моряк совмещали метод культуры ткани in vitro с химиотерапией, используя противовирусные препараты рибавирин (концентрация 0,02-0,03%) и хитозан (0,01-0,1%). Проростки исходных клубней и микрорастения тестировали методами ИФА [22, 23] и ПЦР анализа RQ/Ct (метод определения относительного количества в реальном времени) на скрытую зараженность хозяйственно значимыми вирусами: PVX, PVY, PVA, PVS, PVM, PLRV [24, 25].

В культуру in vitro изолировали верхушечные (апексы) и пазушные почки, взятые от клубней с наименьшей вирусной нагрузкой. Пробирки с эксплантами культивировали в климатической камере MLR-352H (Sanyo) при температуре – 23±1°C, освещенности – 4000 лк, световом дне – 16 час, влажности воздуха – 60-70%. Питательную среду для культивирования растений картофеля готовили по прописи Мурасиге-Скуга (МС) с модификацией содержания компонентов [25], стерилизацию осуществляли при 0,9 атм в течение 20 минут в стерилизаторе паровом ГК-100-3. Инструменты (пинцеты и скальпели) стерилизовали сухим жаром в сухожаровом шкафу FD 240 (Binder) в течение 2 ч при температуре 200°С. Микроклонирование (микрочеренкование) пробирочных растений картофеля проводили в стерильных условиях ламинар-бокса (БАВнп-01-«Ламинар-С»)-1,5.

Результаты исследования

Современная система безвирусного семеноводства картофеля должна основываться на оздоровлении перспективных сортов. Передача в Государственное сортоиспытание оздоровленного от вирусов нового сорта ускоряет процесс сортосмены. При процедуре оздоровления растений картофеля широко распространено использование методов биотехнологии с химиотерапией, основанное на добавлении в питательную среду веществ ингибиторов вирусов: рибавирина (виразола) [26] и хитозана [27]. Для усиления эффекта получило распространение включение в схему при оздоровлении сочетания нескольких ингибиторов вирусов, например, – виразол + интерферон + хитозан, интерферон + хитозан [1], ацетилсалициловая кислота + рибавирин [28].

Для выявления вирусов используют следующие методы тестирования: иммуноферментный анализ (ИФА), имму-нохроматографический анализ (ИХА), ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и ПЦР в реальном времени (RT-ПЦР) [29].

Для оздоровления картофеля перспективного сорта Моряк была применена схема, состоящая из 9 этапов c сопровождением иммуноферментного анализа (ИФА) и ПЦР в реальном времени (RT-ПЦР/ RQ/Ct) (рис.).

На первом этапе с целью введения в безвирусное семеноводство сорта картофеля Моряк перед началом процесса оздоровления, по визуальной оценке, отбирали клубни здоровых растений, в количестве 16 шт. Исходные линии (клубни in vivo с этиолированными 2Т, 3Т, 4Т, 5Т и световыми ростками 1С, 2С, 4С, 5С, 8С) тестировали методом ИФА. В работе Е.С. Беспаловой, М.М. Агаханова, С.Б. Архимандритовой и др. (2020) при оздоровлении сортов картофеля из коллекции ВИР от вирусов были получены результаты тестирования полевых образцов, где установлено, что наиболее встречаемыми вирусами являются: PVX (100%), PVS (100%) и PVA (88,8%). Иммунохимические исследования на сортовых посадках картофеля, проведенные на юге Дальнего Востока показали, что зараженность SВК составила от 33 до 75%; МВК – от 3 до 41%; УВК – от 34 до 50%. Скручивание листьев (ВСЛК) встречалось значительно реже (10-12%). Что свидетельствует о высоком инфекционном фоне в посадках картофеля в Приморском крае [6]. Проведенный нами ИФА-анализ показал наличие вирусной инфекции (PVY, PVS, PVM и PLRV) в различной степени. В результате анализа отобраны образцы с наименьшим количеством вирусов PVY (13,2 %), PVS (12,2 %), PVM (15,6 %) и PLRV (16,2%) для тестирования их методом ПЦР на последующих этапах оздоровления.

Рис. Схема оздоровления сорта картофеля Моряк с применением ИФА и ПЦР-анализа

Fig,Scheme ofimprovementofthe Marinerpotatovarietywith the use ofELISA and PCR analysis

Таблица 1. Результаты тестирования линий картофеля (in vivo и in vitro) после применения рибавирина (0,02%) ПЦР-анализом (RQ/Ct)

Table 1. Results of testing potato lines (in vivo and in vitro) after ribavirin administration (0.02%) by PCR analysis (RQ/Ct)

Линия

PVX

PVY

PVA

PVS

PVM

PLRV

in vivo

in vitro

in vivo

in vitro

in vivo

in vitro

in vivo

in vitro

in vivo

in vitro

in vivo

in vitro

1С

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

-

2С

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

-

4С

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

-

5С

-

-

+

+

-

-

+

+

-

-

-

-

8С

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

+

2Т

-

-

+

+

-

-

+

+

-

-

-

-

3Т

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

-

-

4Т

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

-

-

5Т

-

-

+

+

-

-

+

+

+

-

+

+

Примечание. - вирус не обнаружен; + вирус обнаружен С – клубни со световыми ростками

Т – клубни с этиолированными ростками

При проведении ПЦР-анализа выявили наличие в проростках исходных клубней вирусную инфекцию. Большинство из них были поражены вирусными комплексами PVY, PVS, PVM и PLRV.

На втором этапе работы использовали рибавирин (0,02%) на исходных образцах (in vivo) и микрорастениях ( in vitro ). Через 25 дней культивирования верхушечных изолятов проростков картофеля на питательной среде с рибавирином (0,02%) произвели микрочеренкование растений и перевели на стандартную среду МС без рибавирина. Эффективность применения рибавирина (0,02 %) после проведения повторного ПЦР-анализа подтверждена только против PVМ и PLRV, кроме линий 8С и 5Т. Не удалось получить побеги, полностью свободные от PVY и PVS

(табл. 1). На третьем этапе для размножения и поддержания растений произведено их микрочеренкование на стандартную среду МС без рибавирина.

На четвертом этапе процесса оздоровления использовали ингибитор вируса – хитозан (0,01 %) при выращивании микрорастений in vitro. В табл. 2 представлены результаты ПЦР-анализа и дана оценка вирусной нагрузки исследуемых линий.

ПЦР-анализ позволил выявить линии картофеля с относительно низкой вирусной нагрузкой. Наиболее зараженными оказались микрорастения 1.1 и 1.2, что составляло 33,3 % от линии 1С. С точки зрения вирусной нагрузки микрорастения линий 8С, 2Т, 3Т, 4Т, 5Т показали лучшие результаты – среднее значение RQ составило 0,076.

Таблица 2. Результаты тестирования микрорастений in vitro картофеля после применения хитозана (0,01%) ПЦР-анализом(RQ/Ct) Table 2. Results of in vitro testing of potato micro-plants after chitosan application (0.01%) by PCR analysis (RQ/Ct)

Линия	микрорастения	PVY		PVS		PVM		PLRV
		RQ	Ct	RQ	Ct	RQ	Ct	RQ	Ct
1С	1.1	153,785	20,4599	0,021	32,8576	0,006	32,6354	0,029	32,7301
	1.2	115,724	21,0639	0,014	33,5188	0,004	33,4761	0,025	33,2910
2С	1.3	0,135	33,5039	0,006	35,4422	0	0	0,006	36,1334
	1.4	0,319	31,8532	0,008	34,8405	0	0	0,026	33,5846
4С	1.5	0,079	34,6356	0,009	34,8043	0	0	0,005	35,8905
5С	1.6	0,117	33,6880	0	0	0,002	35,2812	0,008	35,5015
8С	1.7	0,121	33,4658	0,018	33,1980	0,001	35,8849	0,023	33,6356
	1.8	0,048	35,4256	0,004	35,8959	0	0	0,004	36,9644
2Т	1.9	0,103	33,9941	0,014	33,8100	0,003	34,2647	0,017	34,1413
	1.10	0,085	34,3482	0,008	34,7594	0	0	0	0
3Т	1.11	0,095	33,9827	0,030	32,0294	0	0	0,008	35,4287
	1.12	0,038	35,4120	0,035	31,8750	0,003	34,3529	0,014	34,4691
4Т	1.13	0,087	34,2283	0,004	35,8505	0	0	0,013	34,5588
	1.14	0,075	34,2844	0,019	32,8186	0,002	35,3392	0,015	34,3770
5Т	1.15	0,094	34,0481	0,013	33,3438	0	0	0,014	34,5673
	1.16	0,182	32,6048	0,008	34,6432	0	0	0,017	34,1860

Таблица 3. Результаты тестирования микрорастений in vitro картофеля после применения рибавирина (0,03 %) и хитозана (0,1%) Table 3. Results of in vitro testing of potato micro-plants after the use of ribavirin (0.03%) and chitosan (0.1%)

Линия	Микрорастения	PVХ	PVY	PVМ	PLRV	PVS	PVA
рибавирин (0,03 %)
2Т	1.8	-	+	+/-	-	+	-
	1.10	-	-	+	-	+	-
3Т	1.12	-	+	-	+	+/-	-
хитозан (0,1 %)
2Т	1.8	-	-	-	-	-	-
3Т	1.12	-	-	-	-	-	-

Примечание: - вирус не обнаружен; + вирус обнаружен; +/- недостоверный результат (неправильная форма кривой/начало детекции сигнала на последних циклах амплификации)

Микрорастения 1.8, 1.10 и 1.12 показали самый низкий уровень выявленных инфекций и были отобраны для дальнейшего оздоровления. Вирусы PVМ и PLRV в низких концентрациях вновь были обнаружены почти во всех линиях

Ранее проведенные исследования показали, что последовательное культивирование побегов картофеля сорта Моряк на средах с рибавирином в концентрации 0,02 % и хитозаном 0,01 % не позволило полностью устранить вирусные инфекции [24]. Поэтому, на шестом и восьмом этапах, процедуру оздоровления продолжили с применением противовирусных препаратов с увеличенной концентрацией – рибавирин (0,03 %) и хитозан (0,1 %). В результате для дальнейшего эксперимента были отобраны линии 2Т (микрорастения 1.8, 1.10) и 3Т (1.12), у которых отмечено самое низкое содержание исследуемых вирусов (табл. 3)..

Исследования по введению в питательную среду рибавирина в концентрации 0,03% не обеспечило полного освобождения материала от вирусов. Поэтому на 8-м этапе микрорастения 1.8 и 1.12 пассировали на среду с хитозаном в концентрации 0,1% в течение 25 дней. Результаты ПЦР-анализа исследуемых образцов сорта картофеля Моряк показали, что последовательное применение ингибиторов вирусов рибавирина (0,03%) на 6-м этапе и хитозана (0,1%) на 8-м этапе позволило полностью освободить микрорастения картофеля от вирусов и завершить оздоровление сорта Моряк.

В результате исследований разработана схема по освобождению картофеля от хозяйственно значимых вирусов, состоящая из 9-ти этапов. Установлено, что последовательное увеличение концентрации противовирусных препаратов рибавирина (с 0,02 до 0,03%) и хитозана (с 0,01 до 0,1%) является эффективным приемом в оздоровлении микрорастений.

Выводы

Таким образом, применение методов биотехнологии (метод культуры тканей в комплексе с химиотерапией) и тестирование наличия вирусной нагрузки (ИФА и ПЦР анализами) на всех этапах работы позволяет эффективно проводить оздоровление перспективных сортов картофеля. Внедрена схема оздоровления картофеля в процесс производства безвирусных семян ФГБНУ «ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки».

Об авторах:

Irina V. Kim – Cand. Sci. (Agriculture), Leading Researcher, ,

Elena V. Shischenko – Junior Researcher at the

Laboratory of Agricultural Biotechnology,

Petr V. Fisenko – Cand. Sci. (Biology),

Leading Researcher, Acting Head of the Laboratory of Breeding and Genetic Research of Field Crops,

Alena S. Chibizova – Junior Researcher at the

Laboratory of Agricultural Biotechnology,

Alexey G. Klykov – Head of the Department of Breeding and

Biotechnology of Agricultural Crops, Doctor Sci. (Biology), Academician of the Russian Academy of Sciences,

Результаты отбора базовых клонов картофеля в условиях европейского севера и высокогорья Северного Кавказа. Земледелие. 2020;(4):29-32.

• • References (In Russ.)