Применение многомерных методов для разделения сортов риса по реакции на изменение условий среды

В настоящее время значительную часть посевных площадей под рисом занимает ограниченное число сортов. Для их большего генетического разнообразия необходимо повысить эффективность оценки и отбора уникальных генотипов и экологической адресности каждого сорта (1-3).

^∗ Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант ¹ 16-04-230207).

Кроме того, недостаточно полная оценка исходного материала снижает эффективность селекционного процесса. Сложившаяся система не предусматривает детального исследования образцов, передаваемых на конкурсное сортоиспытание (4-5). Продуктивность созданных сортов изучают на одном фоне минерального питания, что приводит к браковке высокопродуктивных форм, для которых этот фон не оптимален. Такой подход не позволяет выявить потенциальную урожайность образца, норму реакции сорта на стрессовые воздействия и доноров высокой функциональной активности генетических систем, определяющих продуктивность и адаптивность (6-7), отсутствует возможность оценить стабильность созданного материала (8-10). В результате ценнейший материал, на создание которого ушли годы работы селекционеров, не находит применения.

Потенциал продуктивности риса, как и многих других культур, со второй половины XX века растет очень медленно. Дальнейшее увеличение производства риса может быть достигнуто за счет интенсификации или продвижения его в регионы с более низкими либо высокими температурами, в зоны с засоленными или затопляемыми почвами (11-13). К середине XXI века изменение климата вызовет повышение средних температур. Кроме того, чаще будут отмечаться кратковременные температурные колебания, не характерные для регионов (изменения климата в зоне тропиков уже вызвало снижение урожаев риса). Повышение температуры на 1 ° С приводит к снижению урожая более чем на 10 % (14, 15). Вследствие подъема уровня моря прогнозируется расширение территорий с засолением почвы (16-18). Следовательно, для увеличения производства культуры требуется не только повысить потенциальную продуктивность, но и обеспечить стабильность урожая и комплексную устойчивость к стрессам (19, 20). При действии абиотических стрессоров сильнее страдают сорта с высокой потенциальной продуктивностью. Именно по этой причине во многих странах растениеводство ориентируют не на максимальную, а на оптимальную и устойчивую урожайность (21-23).

Оценку стабильности материала обычно проводят при его выращивании в различных экологических условиях или с использованием контрастных агротехнических приемов (24-26). Однако в опытах практически не применяются стрессовые фоны (засоление, высокие или низкие температуры) (27-28) и редко изучаются контрастные сроки сева (29-31). Это в значительной мере обедняет получаемую информацию.

Математическую обработку данных, как правило, выполняют с помощью дисперсионного или регрессионного анализа (32-34). Только в последнее время для статистической оценки результатов стали применять многомерные методы (35-37). Их внедрение в практику изучения селекционного материала и перспективных сортов позволит эффективнее выявлять образцы, пригодные для широкого ареала возделывания (38-40). Многомерные методы анализа дают возможность объединить образцы в группы с наиболее близкими ответными реакциями на воздействие различных факторов, определить условия среды, которые позволят максимально точно дифференцировать образцы и потребуют минимальных затрат на проведение эксперимента (41-43), исключить малоинформативные варианты и выявить минимальное число вариантов, позволяющих со 100 % достоверностью отнести образец в соответствующую группу адаптивности (44-46).

В настоящей работе на основе синтеза ранее предложенных методов мы разработали систему оценки селекционного материала, включающую контрастные сроки посева, различные фоны минерального питания, стрессовые фоны. Применение методов многомерной статистики для обработки результатов многократно увеличило информативность данных.

Целью исследования было разделение российских сортов риса на группы по реакции на комплекс факторов среды и определение условий, которые позволяют выполнить такое разделение максимально эффективно.

Методика . В многофакторном опыте (заложен на вегетационной площадке Всероссийского НИИ риса в 2004-2006 годах) исследовали 24 сорта риса ( Oryza sativa L.) отечественной селекции. Растения выращивали в лизиметрических опытах на оптимальном (N₁₂₀P 6 ₀K 6 ₀) и повышенном (N₂₄₀P₁₂₀K₁₂₀) фонах минерального питания; при разреженном (200 растений на 1 м²) и загущенном (300 растений на 1 м²) посеве; разных сроках сева (15 апреля, 15 мая, 15 июня); засолении (создавалось искусственно в фазу кущения посредством внесения в почву NaCl до содержания 0,35 %); недостатке влаги (полив прекращали в фазу выметывания). Выборка составляла 30 растений сорта на вариант опыта. Посев выполняли однорядковыми делянками, по 10 растений в ряду, расстояние между рядками 10 см. Повторность опытов 3-кратная, размещение делянок рендомизированное.

Оценивали продуктивность (массу зерна с растения) у всех растений в опыте. Контролем во всех вариантах было выращивание растений на оптимальном фоне минерального питания (N₁₂₀P 6 ₀K 6 ₀) при разреженном (200 растений на 1 м²) посеве 15 мая. Во всех случаях, кроме загу-шенного посева, норма высева составляла 200 растений на 1 м².

Данные обрабатывали с помощью кластерного и дискриминантного анализа в программе Statistica 6.0 («StatSoft, Inc.», США) (36, 37, 39).

Рис. 1. Кластеризация сортов риса ( Oryza sativa L.) российской селекции по реакции на факторы среды на основании оценки продуктивности (метод Warda) : 1 — Аметист, 2 — Боярин, 3 — Дальневосточный, 4 — Дружный, 5 — Жемчуг, 6 — Изумруд, 7 — Касун, 8 — Курчанка, 9 — Лидер, 10 — Лиман, 11 — Павловский, 12 — Приморский, 13 — Рапан, 14 — Садко, 15 — Серпантин, 16 — Снежинка, 17 — Спринт, 18 — Стрелец, 19 — Факел, 20 — Фонтан, 21 — Хазар, 22 — Юпитер, 23 — Янтарь, 24 — среднее по группе, 25 — модельный (идеальный) сорт.

Результаты. Закладка опыта позволила провести анализ организации генетических систем, определяющих аттракцию продуктов фотосинтеза из стебля и листьев в метелку, их микрораспределение между зерном и мякиной, эффективность почвенного питания, толерантность к загущению, засолению, недостатку влаги, вариабельность длин периодов онтогенеза (1, 2). С помощью кластерного анализа данных по продуктивности сортов во всех вариантах опыта они были разделены на 4 группы с разной реакцией на изучаемые факторы среды (рис. 1).

На следующем этапе с использованием дискриминантного анализа требо- валось оценить достоверность межгрупповых различий по реакции на ком- плекс условий выращивания. Дискриминантный анализ основан на построении линейных комбинаций признак—функция, в которые каждый признак или вариант опыта входит со своим коэффициентом (вкладом). С использованием программы Statistica 6.0 для разделения групп мы построили три дискриминантные функции. Первые две учли более 97 % исходной дисперсии вариантов опыта. Следовательно, в решении последующих задач значениями оставшейся можно было пренебречь, поскольку она учитывала менее 3 % дисперсии.

Оценка достоверности дискриминации групп сортов, выполненная с использованием критерия χ -квадрат, показала, что для их разделения эффективна только первая дискриминантная функция. Вероятность отсутствия межгрупповых различий с ее использованием была меньше допустимого в биологических исследованиях уровня значимости (р < 0,05). Однако даже с использованием первой дискриминантной функции не во всех вариантах опыта удалось равноценно разделить сорта на группы по стабильности продуктивности в различных условиях среды.

С помощью дискриминантного анализа также оценили варианты опыта по возможности их использования для выявления межсортовых различий (табл. 1).

• 1.    Стандартизованные коэффициенты дискриминантных функций при оценке различий между изученными сортами риса ( Oryza sativa L.) по реакции на факторы внешней среды

  Условия среды (вариант опыта)	Первая дискриминантная функция	Вторая дискриминантная функция
  Ранний посев, 2004 год	0,12	- 0,48
  Загущение, 2004 год	0,57	- 1,21
  Поздний посев, 2004 год	0,55	0,81
  Оптимальный срок посева, 2004 год	0,54	- 1,56
  Засоление, 2004 год	- 0,27	3,82
  Высокий фон минерального питания, 2004 год	- 0,38	- 1,12
  Ранний посев, 2005 год	0,06	0,09
  Засоление, 2005 год	0,88	- 0,07
  Поздний посев, 2005 год	0,54	- 0,18
  Загущение, 2005 года	- 2,63	- 1,24
  Недостаток влаги, 2005 года	- 2,16	- 1,09
  Высокий фон минерального питания, 2005 года	- 3,03	0,41
  Оптимальный срок посева, 2005 год	0,26	0,11
  Ранний посев, 2006 года	1,98	2,93
  Оптимальный срок посева, 2006 год	0,35	1,45
  Загущение, 2006 год	- 0,40	- 2,20
  Высокий фон минерального питания, 2006 года	- 1,36	- 0,48
  Поздний посев, 2006 год	- 0,89	- 0,85
  Засоление, 2006 год	0,18	1,98
  Суммарный процент учтенной дисперсии	91	97
  П р и м е ч а н и е. а — варианты опыта, вносящие максимальный вклад в межгрупповые различия.

  

  Рис. 2. Кластерное распределение сортов риса ( Oryza sa-tiva L.) российской селекции в пространстве двух дискриминантных функций по реакции на все изученные факторы внешней среды: 1 — первый кластер (G_1:1), 2 — второй кластер (G_2:2), 3 — третий кластер (G_3:3), 4 — четвертый кластер (G_4:4). Мера сходства — расстояние Маха-ланобиса (D²).

  
  

• 2.    Корректность отнесения сортов риса ( Oryza sativa L.) в кластеры (группы) при дискриминантном анализе с сокращенным числом вариантов опыта относительно исходного

  Группа	Процент корректных отнесений	G_1:1	G_2:2	G_3:3	G_4:4
  G_1:1	100,0000	5	0	0	0
  G_2:2	70,0000	2	7	0	1
  G_3:3	100,0000	0	0	2	0
  G_4:4	100,0000	0	0	0	8
  Всего	88,0000	7	7	2	9

• 3.    Варианты опыта, выделенные при пошаговом анализе вперед, совокупное применение которых позволяет достоверно дискриминировать образцы сортов риса ( Oryza sativa L.) на группы с разной адаптивностью и стабильностью продуктивности

  Вариант	F                 1	p
  Высокий фон минерального питания, 2005 год	53,856	0,000
  Недостаток влаги, 2005 год	4,736	0,021
  Ранний посев, 2004 год	3,855	0,038
  Оптимальный срок посева, 2005 год	3,089	0,068а
  Поздний посев, 2006 год	2,069	0,158а
  Загущение, 2005 год	4,271	0,029
  Высокий фон минерального питания, 2006 год	2,198	0,141а
  Оптимальный срок посева, 2004 год	1,638	0,233а
  Загущение, 2006 год	1,179	0,359а
  Засоление, 2004 год	1,011	0,422а

Абсолютные значения стандартизированных коэффициентов дискриминантных функций позволяют судить о вкладе конкретной переменной или варианта опыта в конечное значение функции и ответить на вопрос об их роли в межгрупповых различиях. В нашем случае максимальные абсолютные значения отме- чали для пяти вариантов опыта, которые вносили максимальный вклад в разделение групп по реакции на условия среды: ранний посев в 2006 году, повышенный фон минерального пи- тания в 2005 и 2006 годах, загущение и недостаток влаги в 2005 году. Сле-

дует отметить, что стандартные условия выращивания во все годы исследования в меньшей степени позволяли дифференцировать образцы, о чем свидетельствовали сравнительно низкие абсолютные значения коэффициентов дискриминантных функций.

Одним из результатов дискриминантного анализа была оценка степени сходства реакции на условия среды выделенных групп посредством вычисления расстояния между их центроидами. В качестве меры сходства выступало расстояние Махаланобиса (D2), которое оказалось максимальным между третьей, второй и четвертой группами, что свидетельствует о наиболее значительных генетических различиях между ними (рис. 2).

Для выявления группы сортов с максимальными показателями продуктивности в разных условиях среды в анализ также включили модель сорта, которой присвоили наибольшее значение массы зерна с растения во всех исследуемых вариантах опыта. Модельный (идеальный) сорт кластеризовался вместе с сортом Курчанка. Сорта из первой группы оказались наиболее близки по продуктивности к модельному сорту во всех вариантах опыта, то есть наиболее стабильно проявляли высокую продуктивность в изучаемых условиях. К первой группе относились сорта Дальневосточный, Изумруд, Павловский, Приморский, Фонтан; ко второй — Аметист, Боярин, Дружный, Лидер, Рапан, Спринт, Хазар, Юпитер, Янтарь; к третьей — сорт Курчанка и модель идеального сорта; к четвертой — сорта Жемчуг, Касун, Лиман, Садко, Серпантин, Снежинка, Стрелец, Факел. Оценка с использованием критерия Фишера показала достоверность различий между третьей и четвертой группами (кластерами) (вероятность нуль-гипотезы 0,035), а также между первой и четвертой группами (вероятность нуль-гипотезы 0,048). Первая и вторая группы сортов различались недостоверно.

Абсолютные значения стандартизированных коэффициентов дискриминантных функций не только позволяют судить о вкладе конкретной переменной в эту функцию и определить ее роль в межгрупповых различиях, но и сократить число изучаемых вариантов. Так, если абсолютная величина стандартизированных коэффициентов дискриминантных функций переменной (варианта опыта) мала, то ее можно исключить из анализа. Эта процедура называется определением информативного списка признаков. Мы воспользовались ею для установления условий среды, которые позволят масимально полно выявить межгрупповые различия при сокращении числа вариантов опыта.

Наиболее значительное сокращение вариантов опыта обеспечивает пошаговый анализ назад, который мы использовали для решения задачи. Было установлено, что даже два варианта опыта позволяют достоверно разделить группы сортов по реакции на условия среды. В 2005 году в вариантах с высоким фоном минерального питания и недостатком влаги была получена максимально высокая продуктивность образцов по сравнению с показателем в 2004 и 2006 годах. Следовательно, условия среды, благоприятные для реализации потенциала продуктивности сортов, позволяют корректно сравнивать образцы. Создание стресса на фоне других благоприятных факторов расширяет размах варьирования признаков и дисперсию в опыте, в результате чего удается более достоверно разделить сорта на группы.

В генетических исследованиях чаще всего требуется выделить наиболее характерных представителей каждого кластера (группы). В этом случае отнесение пограничных образцов не в свою группу не снижает эффективности работы. Следовательно, наша задача — максимально сократить число вариантов опыта и в то же время добиться сохранения точности выделения характерных представителей кластера.

Результаты кластеризации исследуемых сортов риса при использо-

Рис. 3. Кластерное распределение сортов риса ( Oryza sati-va L.) российской селекции в пространстве двух дискриминантных функций по реакции на высокий фон минерального питания и недостаток влаги: 1 — первый кластер (G_1:1), 2 — второй кластер (G_2:2), 3 — третий кластер (G_3:3), 4 — четвертый кластер (G_4:4).

вании двух выделенных вариантов опыта (высокий фон минерального питания и недостаток влаги) показали, что 88 % образцов были классифицированы верно, что приемлемо для генетических исследований. При этом в первой и третьей группах имело место полное совпадение с результатами оценки по всем вариантам опыта, а из второй группы только три образца попали в другой кластер (один — в четвертую группу и два были отнесены к первой) (рис. 3, табл. 2).

Дискриминантный анализ также показывает расстояние каждого сорта от центроида группы. Образцы с минимальным расстоянием от него — это наиболее характерные представители группы, которые могут использоваться как источники генов по изучаемому признаку, контрастные формы при подборе пар для гибридизации или молекулярном маркировании и локализации генов количественных признаков.

П р и м е ч а н и е. G_ — группа образцов, G_1:1 — число образцов, относящихся к первой группе (при анализе всех вариантов опыта), отнесенных в свою группу в случае сокращения числа анализируемых вариантов при дискриминантном анализе.

П р и м е ч а н и е. а — варианты, недостоверно дискриминирующие образцы; F — критерий Фишера, p — вероятность отсутствия межгрупповых различий при использовании варианта опыта.

Для получения более точных результатов, например для составления баз данных по вкладу генетических систем в продуктивность или адаптивность, необходимо увеличить число вариантов опыта до значений, позволяющих достоверно разделить и классифицировать образцы. Задача может быть выполнена с помощью пошагового анализа вперед, который в значительно меньшей степени сокращает число вариантов опыта. Использование такого анализа дало нам возможность выделить десять вариантов, которые позволяют со 100 % эффективностью разделить образцы на группы с различной адаптивностью и стабильностью продуктивности (табл. 3).

Таким образом, мы установили, что стандартные условия выращивания в меньшей степени позволяют дифференцировать сорта риса по реакции на факторы среды. Для определения стабильности и пластичности образца необходимо закладывать опыты, обеспечивающие более значительный размах варьирования признака при внешних воздействиях. В наших исследованиях этими условиями оказались повышенный фон минерального питания, повышенная плотность посева, недостаток влаги в фазу созревания и ранний посев. Наибольшую стабильность по продуктивности при дискриминантном анализе проявили сорта Дальневосточный, Изумруд, Павловский, Приморский, Фонтан, Аметист, Боярин, Дружный, Лидер, Рапан, Спринт, Хазар, Юпитер, Янтарь (первый и второй кластеры), которые мы рекомендуем использовать в качестве источников по признаку «стабильно высокая продуктивность в различных условиях среды». Сорта Курчанка, Жемчуг, Касун, Лиман, Садко, Серпантин, Снежинка, Стрелец, Факел (четвертый и третий кластеры) оказались менее стабильными, несмотря на то, что в одну из групп при кластеризации попал модельный идеальный сорт.