Применение паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток в послеоперационном периоде кератопластика высокого риска в эксперименте

Актуальность

Ожоговая травма органа зрения составляет от 4,2% до 38,4% всех глазных травм, и, в большинстве случаев, происходит у молодого и трудоспособного населения [1]. В Российской Федерации ежегодно проводится около 2500–3000 кератопластик при бельмах, посттравмати-

Трифаненкова И.Г., Темнов А.А., Булатова Ю.Д. и др.

ПРИМЕНЕНИЕ ПАРАКРИННЫХ ФАКТОРОВ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ КЕРАТОПЛАСТИКА ВЫСОКОГО РИСКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ ческих рубцах, дистрофиях роговицы, язвах роговицы различной этиологии, кератоконусе. По данным авторов, общие показатели выживаемости трансплантата через 10 лет после сквозной кератопластики составляют 79,3% [2]. Однако при кератопластиках высокого риска, например, у пациентов с постожоговыми бельмами, показатель прозрачного приживления роговичного трансплантата составляет от 20 до 45% [3].

Основными причинами отторжения трансплантата являются антигены гистосовместимости и васкуляризация роговицы реципиента. Роговица является уникальной «иммунопривелигированной» тканью вследствие ее аваскулярности [4]. Дисбаланс про- и антиангиогенных факторов, возникающий в результате ожоговой травмы, приводит к неоваскуляризации роговицы [5]. Одним из решений данной проблемы может быть использование в лечении и профилактике осложнений неоваскуляризации роговицы мезенхимальных стволовых клеток (МСК) [6–9].

В экспериментальных работах была продемонстрирована эффективность применения МСК в лечении ожоговых бельм роговицы [10–12]. Однако клиническое применение МСК ограничено законодательством РФ. Выходом в данной ситуации может стать применение кондиционированных сред, содержащих паракринные факторы МСК (КС-МСК).

Цель – представить предварительные результаты применения паракринных факторов мезенхимальных стволовых клеток в послеоперационном периоде кератопластики высокого риска у животных на фоне пред-существующего неоангиогенеза.

Материал и методы

В исследование, состоящее из двух этапов, были включены 12 кроликов (12 глаз) породы серая шиншилла весом от 2,5 до 3,2 кг. На первом этапе 8 животным (8 глаз) был смоделирован термический ожог роговицы в периферической зоне с захватом лимбальной зоны. Затем на всех глазах с термическим ожогом проводилась сквозная кератопластика по стандартной технологии. В качестве доноров использовали 4 кроликов (8 глаз).

На втором этапе были сформированы контрольная (4 кролика, 4 глаза) и опытная группы (4 кролика, 4 глаза). В опытной группе в качестве послеоперационного лечения применяли инстилляции КС-МСК. Инстилляции проводились с 1-х по 14-е стуки четырехкратно. В контрольной группе лечение проводилось путем инстилляции антибиотиков (Офтаквикс) и кератопротекторов (Корнерегель) трехкратно в течение 14 дней.

Сроки наблюдения составили 1-е, 3-и, 7-е, 14-е сутки, в которые выполняли офтальмоскопию переднего отрезка глаза щелевой лампе Topcon SL-2G с последующей фоторегистрацией на щелевой лампе Haag-Streit Diagnostics BP 900, исследование на приборе Pentacam AXL.

Перед получением экспериментальной модели термического ожога роговицы выделяли стволовые клетки костного мозга кроликов и по ранее описанной методике [10] получали препарат пептидов, который представлял собой прозрачную гомогенизированную жидкость малинового цвета.

На первом этапе эксперимента для создания модели термического ожога роговицы использовали специальное устройство с металлическим цилиндром, которое подключали к источнику переменного тока; максимальный пик температуры составлял 210 °С. Перед термическим воздействием в конъюнктивальную полость закапывали 0,5% раствор проксиметакаина. Ожог наносился путем установки основания данного цилиндра на периферическую область с захватом лимбальной зоны роговицы подопытных животных на 3 секунды [10].

В ранее проведенном исследовании было установлено, что используемая модель термического ожога позволяет к 7-м суткам получить обильное прорастание сосудов лимбальной сети в роговицу опытных животных, а к 14-м суткам получить формирование стойкого не-оваскулярного бельма роговицы [11; 12].

На 15-й день эксперимента проводилась сквозная кератопластика по стандартной технологии. Операция выполнялась под общим наркозом. Первоначально проводилась обработка операционного поля 0.5% раствором хлоргексидина дважды. У кролика-реципиента с помощью механического трепана выкраивался сквозной диск диаметром 8.0 мм и удалялся.

Донорская роговица выкраивалась из предварительно энуклеированного глаза донора при помощи трепана диаметром 8.25 мм и переносилась на подготовленное ложе пациента. Роговичный трансплантат фиксировался четырьмя узловыми швами 8-0. Далее накладывалось 16 узловых швов 10-0, после чего снимались узловые провизорные швы 8-0. Передняя камера восстанавливалась физиологическим раствором (NaCl 0,9%).

На втором этапе эксперимента на 1 сутки после проведенной кератопластики начиналось лечение в опытной и контрольной группах по вышеописанной схеме.

Результаты

Кератопластика проводилась на 15-е сутки после формирования неоваскулярного бельма роговицы. К этому моменту индуцированные неоваскулярные бельма у всех животных были сходны по площади, глубине, частоте новообразованных сосудов и денситометрии.

По данным офтальмоскопии, на 1-е сутки в опытной и контрольной группах наблюдалась умеренная светобоязнь, конъюнктивальная инъекция сосудов. Трансплантат роговицы был прозрачным, отечным, ушит узловыми швами. Швы чистые, состоятельные. Передняя камера средней глубины, влага прозрачная. Радужка структурная, зрачок 3 мм. В области зрачка визуализировалась экссудативная пленка. Хрусталик прозрачный. Рефлекс розовый, снижен за счет экссудативных мембран.

На 3-е сутки в опытной группе трансплантат роговицы был прозрачным, ушит узловыми швами. Шов

чистый, состоятельный. Передняя камера средней глубины, влага прозрачная. Радужка структурная, зрачок 3 мм, хрусталик прозрачный. Остатки экссудативной пленки по зрачковому краю. Рефлекс розовый. В контрольной группе отмечалось умеренное слизистое отделяемое, стромальный отек трансплантата роговицы в оптической зоне, трансплантат ушит узловыми швами, швы состоятельные. В зрачке визуализировалась экссудативная мембрана, которая частично закрывала просвет зрачка, с увеличением плотности.

На 7-е сутки в опытной группе трансплантат роговицы был прозрачный, ушит узловыми швами. Шов чистый, состоятельный. В контрольной группе – умеренное слизистое отделяемое, стромальный отек трансплантата роговицы, трансплантат ушит узловыми швами, швы провисали. Отмечалась неоваскуляризация трансплантата роговицы с 9 до 3 часов с прорастанием на 4 мм. Радужка структурная, зрачок 3 мм, остатков экссудативной мембраны не наблюдалось.

На 14-е сутки в опытной группе трансплантат роговицы был прозрачным, ушит узловыми швами (Рис. 1 А). Отмечались единичные стволы новообразованных сосудов с прорастанием в трансплантат не более 1 мм. Шов чистый, состоятельный. Передняя камера средней глубины, влага прозрачная. Радужка структурная, зрачок 3 мм, хрусталик прозрачный. Рефлекс розовый. В контрольной группе наблюдали умеренное слизистое отделяемое, стромальный отек трансплантата роговицы, швы провисали. Отмечалась неоваскуляризация роговицы с 9 до 3 часов с прорастанием на 4 мм (Рис. 1 Б).

Обсуждение

В настоящее время доказано, что активизация иммунных процессов является главным препятствием в достижении оптимальных результатов кератопластики при васкуляризированных бельмах роговицы. Новообразованные сосуды облегчают проникновение эффекторных Т-клеток в трансплантат, что и является причиной развития алло-отторжения [13]. Именно поэтому ангио- и лимфангиогенез при кератопластике требует особого внимания [5; 14–16].

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются самообновляющимися и способны дифференцироваться в другие типы клеток при определенных условиях.

Исследование Ма и соавт. продемонстрировало восстановление поврежденной роговицы крыс, обработанной человеческими МСК (чМСК). Это что позволило предположить, что чМСК ингибируют как воспаление, так и связанный с воспалением ангиогенез [9].

Учитывая ограниченное клиническое применение МСК в РФ, мы посчитали перспективным применение кондиционированных сред, содержащих паракринные факторы МСК (КС-МСК). В проведенных раннее исследованиях было показано, что терапевтический эффект МСК по крайней мере частично опосредован паракринными трофическими факторами, секретируемыми клетками.

Рис. 1. Фотография переднего отрезка глаза кролика на 14-е сутки после кератопластики: А – опытная группа; Б – контрольная группа.

В свою очередь, различные факторы роста, цитокины и белки внеклеточного матрикса входят в состав питательных сред МСК, что тоже объясняет эффективность КС-МСК [17].

Проведенное нами на втором этапе эксперимента послеоперационное лечение с применением КС-МСК показало выраженный антиангиогенный эффект, что подтверждалось отсутствием выраженной васкуляризации донорской роговицы на 14-й день инстилляций препарата. В контрольной группе с 7-х суток фиксировались отек и помутнение роговицы, неоваскуляризация донорской роговицы. Учитывая имеющиеся данные, мы предполагаем, что именно ингибирование как воспаления, так и связанного с ним лифо- и ангиогенеза, может объяснять более качественное восстановление и приживление донорской роговицы у животных, получавших в качестве лечения КС-МСК.

Заключение

Применение раствора КС-МСК показало себя эффективным в послеоперационном периоде кератопластики высокого риска у животных в эксперименте на фоне предсуществующего неоангиогенеза. Необходимо проведение экспериментальных исследований на более длительных сроках для оценки отдаленных результатов, а также подтверждение полученных результатов данными инструментальных и гистологических исследований на всех сроках наблюдения.

Трифаненкова И.Г., Темнов А.А., Булатова Ю.Д. и др.

ПРИМЕНЕНИЕ ПАРАКРИННЫХ ФАКТОРОВ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В ПОСЛЕОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ КЕРАТОПЛАСТИКА ВЫСОКОГО РИСКА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-25-10091, https://rscf.ru/project/ 23-25-10091/.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов (The authors declare no conflict of interest).