Применение ПЦР-метода для маркирования сельскохозяйственных растений

Специфическое взаимодействие белков по принципу узнавания ими определенных участков в нуклеотидных последовательностях ДНК играет исключительно важную роль в генетической регуляции генома путем непосредственного блокирования и деблокирования его отдельных областей и локусов или через соответствующие структурные переходы в хромосомах [6].

Принципы и методы маркирования генетических систем организма по ДНК основаны на использовании самого высокоспецифичного ингредиента клетки , стоящего на вершине иерархии систем генетической информации . В то же время следует иметь в виду , что ДНК с ее биологической специфичностью формируется при непосредственном участии большого числа ферментов и других белковых факторов , многие из которых , кроме функциональной специфичности , наделены также видовой , сортовой и индивидуальной специфичностью . Можно себе представить , что ДНК с ее биологической и генетической специфичностью создается всей участвующей в репликации совокупностью множества белков . Последние разными путями механизма биосинтеза несут в формирующиеся дочерние нити ДНК информацию наследственных свойств , присущих данному виду , сорту и т . д . Ведущую роль белковым системам придается не только в репликации ДНК , но и в эволюции генома . Стабильность геному и медленному ходу его эволюции придает полуконсервативный матричный синтез [4, 6].

Белковые факторы репликации ДНК , возможно , являются основными агентами , доставляющими информацию на генетические сдвиги в онтогенезе и эволюции .

Главные по функциональному значению элементы генома представлены генами , кодирующими белки и все типы молекул РНК , участвующие в белковом синтезе . Суммарная длина их , выраженная числом пар нуклеотидов ( п . н .), составляет у высших растений , как и у млекопитающих , всего лишь 3…5 % протяженности всего генома . Остальная часть его представлена разными служебными и вспомогательными нуклеотидными последовательностями : ДНК - интронами в структурах самих генов , промоторами в начале считывания , то есть транскрибирования генов РНК - полимеразами , а также другими некодирующими межгенными участками , выполняющими регуляторные функции или имеющими интегрирующее значение для отдельных хромосом или всего генома [7].

Некодирующая часть геномной ДНК , часто используемая в маркировании , в основном организована в виде повторяющихся нуклеотидных последовательностей ( повторов ). Они могут быть рассыпаны по гену или собраны в связанные между собой последовательности , образуя тандемные повторы , с разным числом сцепленных друг с другом нуклеотидных пар [4, 6].

Повторяющиеся последовательности могут составлять у растений до 80% и более тотальной ДНК . Подавляющая часть тандемных повторов генома , однако , состоит из некодирующихся последовательностей ДНК . Из повторяющихся последовательностей состоят также прицентромерные участки ДНК хромосом [11].

Анализ ДНК , который напрямую характеризует геном , а не его фенотипические проявления , может дать устойчивые характеристики растения ( дескрипторы ), нейтральные по отношению к среде обитания и практически пригодные для идентификации и различения генотипов , регистрации сортов и маркирования хозяйственно ценных генов и признаков .

Совершенно иная ситуация возникла с открытием полиморфизма длины растительных фрагментов ДНК, а также с разработкой методов полимеразной цепной реакции, анализа маркеров случайным образом амплифицированной полиморфной ДНК. Эти подходы позволяют маркировать практически любой участок хромосомы и затем путем анализа последующих поколений установить их сопряженность с количественными и качественными признаками. Более того, появилась возможность быстро картировать гены, несущие определенные хозяйственные признаки, и затем их клонировать и перемещать в другие геномы с целью улучшения существующих сортов гибридов. Все эти методы широко используются в генетике человека, но в последние годы их применяют в решении задач генетики и селекции растений [4].

Существенно ускоряет и упрощает задачу выявления молекулярных маркеров использование методов , основанных на полимеразной цепной реакции ( ПЦР ). Широкое применение нашли варианты амплификации ДНК с произвольными праймерами . С их помощью можно быстро обнаружить вариабельность большого числа локусов по всему геному [1, 3, 10].

ДНК анализ с применением праймеров Paw5 и Paw8 позволили различить рожь , пшеницу и пырей (2). Причем различия между сортами пшеницы не обнаружены . Это объясняется их близкородственным происхождением . Наряду с этим проводится анализ ДНК - маркера , специфичного для G- генома пшеницы [8].

Широко применяются ДНК маркеры в селекции картофеля , в частности используется ДНК - маркер гена устойчивости к раку картофеля [2,3]. С использованием ДНК - маркеров проводится оценка устойчивости корейских сортов сои к соевой нематоде [10].

В исследованиях В . В . Соболева (2004) с успехом применяется метод ПЦР для генетического маркирования ремонтантной малины .

Исследованиями ряда авторов показана возможность использования ДНК - маркеров при анализе встречаемости компонентов RAPD- спектров у изучаемых сортов пшеницы и ячменя , различных мелкосеменных видов и подвидов просовидных культур [5].

Представительность стержнев o й коллекции фасоли (Phaseolus vulgaris) в генбанке CIAT (n = 23000) была испытана с использованием белковых и нескольких ДНК методов . Стержневую коллекцию фасоли перуанского происхождения сравнивали с образцами резервной коллекции . При этом , по данным полиморфизма белков , в 100 образцах стержневой коллекции обнаружено 95,7 % разнообразия , идентифицированного по спектрам полиморфных белков 382 образцов резервной коллекции . RAPD- анализ также подтвердил корректность формирования стержневой коллекции из 90 образцов для фасоли перуанского происхождения .

Достижения в молекулярной биологии , в частности , развитие таких технологий , как полимеразная цепная реакция ( ПЦР ) – амплификация ДНК , сиквенс ДНК – определение последовательности ДНК , современные методы анализа и обработки данных значительно повысили возможности молекулярных технологий в скрининге и оценке генетического разнообразия [7].

В настоящее время существует много современных подходов ( технологий ) выявления полиморфизма на уровне ДНК , среди которых можно выделить следующие : анализ полиморфизма длины рестриктных фрагментов ДНК ; « целенаправленная » ПЦР ; ДНК – сиквенс .

Метод ПЦР предполагает использование специфических праймеров и получение дискретных ДНК – продуктов . Большое число родственных технологий построено на этом принципе . Полиморфизм определяется как присутствие – отсутствие в электрофоретических спектрах специфических фрагментов ДНК , обусловленных различиями последовательностей ДНК в местах посадки праймеров . Подход методически относительно прост и может применяться для изучения разнообразия на внутривидовом уровне , включая популяционные исследования . Только анализ ДНК , который напрямую характеризует геном , а не его фенотипические проявления , может дать устойчивые характеристики растения , нейтральные по отношению к среде обитания и практически пригодны для идентификации и различения генотипов , регистрации сортов и маркирования хозяйственно ценных генов и признаков [2].

В связи с вышеизложенным , целью представленной работы является выявление полиморфизма образцов фасоли и пшеницы на различных праймерах . Изучали полиморфизм образцов фасоли и пшеницы . Для амплификации геномной ДНК использовали праймеры : Bare, Paw S5, Paw S6, Paw S11, Paw S16, P21, P27, P54, P191, P196, P198, P200. Праймеры применяли в различной комбинации попарно и по одному . В результате ПЦР анализа образцов фасоли установлены межсортовые различия при использовании праймеров Bare. В результате ПЦР анализа образцов пшеницы установлены межвидовые различия по всем сортам пшеницы при использовании праймера Paw S6.

М атериал и методы

С целью изучения полиморфизма в работе анализировались образцы фасоли (15 сортов ) и пшеницы (13 сортов ) из коллекции ВИР , селекции Всероссийского научно - исследовательского института зернобобовых и крупяных культур РАСХН ( Орел ) и Института биохимической физики им . Н . М . Эмануэля РАН ( Москва ), отличающиеся морфобиологическими и биохимическими особенностями . Выделение ДНК проводили из молодых листьев с помощью набора реагентов DIAtom^TMTMA Prep 100.

Для амплификации геномной ДНК использовали праймеры : Bare, Paw S5, Paw S6, Paw S11, Paw S16, P21, P27, P54, P191, P196, P198, P200. Праймеры применяли в различной комбинации попарно и по одному . ПЦР проводили в амплификаторе производства « БиоКом » с помощью сухого набора реагентов для ПЦР амплификации GenePak Universal. Амплификация включала 1 цикл продолжительностью 2 мин денатурации при +94° С , 30 циклов (1 мин денатурации цепей ДНК при +94° С , 40 с отжима праймеров с матрицей при +50° С , 100 с синтеза комплементарных цепей ДНК при +72° С ) и завершающего синтеза в течение 7 мин при +72° С . Для разделения продуктов амплификации использовали электрофорез в 1,5%- ном агарозном геле .

Результаты

В результате ПЦР анализа образцов фасоли установлены межсортовые различия по всем образцам фасоли при использовании праймеров Bare.

Выявлено , что образцы фасоли имеют основные фрагменты , которые находятся в зоне работы маркера от 600 до 1000 п . н . Для большинства исследованных образцов характерно наличие фрагмента в зоне около 34

600 п . н . у трех образцов : Л 179, Шоколадница , К 15196 таких фрагментов нет ( рисунок 1). Вторым характерным моментом является наличие фрагмента в зоне около 450550 п . н . Во всех образцах имеются фрагменты около 150 н . п . Таким образом , методом Полимеразной цепной реакции установлены фрагменты продукта амплификации ДНК , соответствующие 600, 450 – 550 и 250 п . н ., характерные для всех сортов фасоли , а в зоне от 100 до 550 п . н . обнаружены фрагменты ДНК , дающие возможность выявлять межсортовой полиморфизм по ДНК – маркерам .

1000 п . н .

500 п . н .

400 п . н .

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Рисунок 1 – Продукты амплификации ДНК образцов фасоли с праймером Bare (1- Контроль , 2- Оран , 3- Рубин , 4- Л 543/84, 5- Ока , 6- Неруса , 7- Л 202, 8- Л 714, 9- Л 179, 10- Шоколадница , 11- К 15038, 12- К 15077, 13- К 13627, 14- К 15196, 15- К 15127, 16- Бельская , 17- Маркер )

В результате ПЦР анализа образцов пшеницы установлены межвидовые различия по всем сортам пшеницы при использовании праймера Paw S6.

Выявлено , что сорта пшеницы имеют основные фрагменты , которые находятся в зоне работы маркера от 100 до 800 п . н . ( рисунок 2).

1000 п . н .

900 п . н .

800 п . н .

700 п . н .

500 п . н .

400 п . н .

100 п . н .

1   2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Рисунок 2 – Продукты амплификации ДНК сортов пшеницы с праймером Paw S6 (1- Контроль , 2- Ритза , 3- Беседа , 4- Ботовская 1, 5- Сибирская нива , 6- Имени Рапопорта , 7- Белая , 8- Волжанка Елена , 9- Булава , 10- Московская 39, 11- Бешкиль 500, 12- Мироновская 808, 13- Крестьянка , 14- Труженица , 15- Маркер )

У всех сортов пшеницы имеются фрагменты около 500-700 п.н. Для большинства исследованных сортов пшеницы характерно наличие фрагмента в зоне 750 п.н., у четырех сортов: Сибирская нива, Имени Рапопорта, Бешкиль 500, Мироновская 808 таких фрагментов нет. Вторым характерным моментом является наличие фрагмента в зоне около 450-500 п.н. у сортов пшеницы Беседа, Сибирская нива, Имени Рапопорта, Белая, Мироновская 808, Труженица. Фрагмент в зоне около 250-400 п.н. только у сортов Ритза, Беседа, Ботовская 1, Волжанка Елена, Мироновская 808, Московская 39. Таким образом, методом Полимеразной цепной реакции установлены фрагменты продукта амплификации ДНК, соответствующие 500-700, 200 п.н., характерные для всех сортов пшеницы, а в зоне 750, 250 - 450 п.н. обнаружены фрагменты ДНК, дающие возможность выявлять межсортовой полиморфизм по ДНК-маркерам.

При использовании других праймеров не удалось обнаружить существенных различий межу образцами фасоли и пшеницы .

Таким образом , данные , полученные в результате изучения продуктов амплификации и полиморфизма , могут быть использованы для идентификации и классификации указанных образцов методом ПЦР анализа .