Применение твердофазной экстракции для пробоподготовки при анализе ивабрадина в биопробе

При анализе фармакокинетических параметров лекарственных средств встает вопрос определения концентраций лекарственного препарата в плазме крови и других биологических пробах.

Наиболее эффективным и чувствительным методом для данной цели в настоящее время является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Данный метод позволяет определять концентрации практически всех экзогенных и эндогенных субстанций в биологических образцах в минимальных концентрациях. Существует большое количество разнообразных типов хроматографических детекторов – ультрафиолетовый, флуоресцентный, электро-кондуктометрический, масс-спектрометрический и т. д., что позволяет подбирать оптимальные условия для каждого соединения.

Но одной из проблем данного метода является влияние чистоты пробы на уровень количественного и качественного определения химического соединения, поскольку наличие посторонних соединений и примесей негативно влияет на возможность точной идентификации каждого соединения на хроматограмме, а также способно снизить чувствительность метода из-за слияния пиков на конечной хроматограмме. Особенно это является актуальным для биологических проб, так как они содержат большое количество как эндогенных, так и экзогенных соединений.

В связи с этим большую важность приобретает проблема очистки биологических проб перед определением в них искомого вещества или группы веществ.

Для очистки биологической пробы от посторонних примесей разработано и существует множество различных методик – экстракция (как жидкостная, так и твердофазная), осаждение посторонних примесей, дериватизация определяемого соединения и т. д. Но необходимо также учитывать, что концентрация определяемого соединения может быть ниже порога определения, что приведет к невозможности его идентификации даже при условии тщательной очистки пробы. Поэтому пробоподготовка в большинстве случаев включает в себя этап концентрирования для повышения чувствительности методики.

При концентрировании образца необходимо добиться таких условий, чтобы метод был воспроизводим и позволял определять данное вещество количественно.

Поэтому наиболее оптимальным методом представляется экстракция на твердом сорбенте, так как он позволяет, с одной стороны, очистить пробу от посторонних примесей, и, с другой – сконцентрировать определяемое вещество до необходимой концентрации выше порога определения.

В данном исследовании мы разрабатывали метод пробоподготовки лекарственного препарата «Ивабрадина» в моче и плазме крови. Ивабрадин является представителем нового класса лекарственных кардиотропных препаратов – ингибиторов f-каналов, но в связи с наличием у него некоторого количества побочных эффектов, а также возможного его влияния на систему цитохрома Р-450 3А4 представляется необходимым контролировать его метаболизм, в частности, концентрацию ивабрадина и его метаболита в биологических жидкостях.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Подобрать оптимальные условия извлечения ивабрадина, его метаболита и внутреннего стандарта, необходимого для количественного определения ивабрадина из биологических жидкостей – крови и мочи.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовались стандарт ивабра-дина (производства компании Servier, France), стандарт метаболита ивабрадина – N-деметил-ивабрадин (Toronto Research Chemicals, Canada). В качестве внутреннего стандарта использовалась субстанция домперидона (Toronto Research Chemicals, Canada).

Количественное определение проводили на хроматографе Shimadzu LC-20AD с флуоресцентным детектором Shimadzu RF-10Axl.

Для концентрирования исследуемых соединений использовался манифолд Isolute VacMaster и картриджи для концентрирования Isolute SPE-CN 1 ml, Isolute SPE-C18 1 ml.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для определения оптимальных условий пробоподготовки были опробованы различные варианты концентрирования биопроб: использование картриджей с различной привитой фазой (-С18 и -CN), различные варианты смыва с картриджей (метанол и ацетонитрил порциями различного объема), вариация значений рН (нейтральная и щелочная фазы), а также концентрирование при помощи упаривания.

В результате проведенного исследования было установлено, что наиболее оптимальным является использование картриджей с привитой -СN-фазой, которые показывают лучшие результаты по сравнению с -С18. В качестве пробы использовалось 1 мл плазмы, отцентрифугированной при 3 тыс. об./мин в течение 15 минут. После нанесения пробы на картридж в дальнейшем производился смыв пробы метанолом объемом 3 мл, после чего метанол упаривался под вакуумом при помощи водоструйного насоса. Получившийся сухой остаток при этом растворялся в 100 мкл метанола, и получившийся раствор наносился на хроматографическую колонку.

При данных условиях достигалась максимальная степень извлечения всех необходимых веществ – ивабрадина, его метаболита и внутреннего стандарта – домперидона.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, для пробоподготовки изучаемых соединений разработан метод твердофазной экстракции с использованием картриджей с привитой -CN-фазой с последующим упариванием.

Способ извлечения подобран оптимально и практически не влияет на среднюю ошибку измерения хроматографического метода количественного определения.