Прижизненное неразрушающее определение площади листьев растений огурца для массового анализа

Лист – важный орган растения с ограниченным ростом, уплощенной формы, выполняющий три основные метаболические функции: фотосинтез, газообмен и транспирацию. Фотосинтез – это процесс преобразования солнечной энергии в метаболиты, являющееся строительным материалом растения. В условиях, когда другие параметры (питание, влажность и т.д.) окружающей среды являются оптимальными, продуктивность растений определяется количеством световой энергии, которую растение может улавливать [1]. Соответственно, площадь листьев является наиболее важным фактором, способствующим росту и продуктивности растений [2]. Кроме этого, интенсивность транспирации прямо влияет на ток соков по сосудам растения и далее на степень поглощения питательных веществ. Поэтому величина площади листьев является основным фактором развития растений из-за ее влияния на все эти процессы [3]. По этой причине измерение площади листьев является важнейшим моментом при оценке большинства агрономических и физиологических исследований, включая развитие растений [4].

Классические методы оценки площади листьев, свя- занные с отделением листьев от растения и измерением их площади, являются трудоёмкими и не подходят для опытов с небольшим количеством образцов. По этой причине многие ученные стремились разработать простой, недорогой и неразрушающий метод оценки площади листьев.

Неразрушающее измерение площади без отрыва листьев является более предпочтительным в исследованиях на одном и том же растении и листе, что позволяет учитывать динамику процессов в ходе испытаний. Кроме того, возможность определения площади листа с помощью простых линейных измерений устраняет необходимость в дорогостоящих и сложных устройствах для измерения площади листа типа электронных планиметров. По этой причине прогнозирование с помощью математических моделей с использованием данных о размере листьев, полученных путем линейных измерений листьев, очень полезно в исследованиях [5].

Многократно проводили разработку таких методов на различных сельскохозяйственных культурах, таких, как виноград [6], земляника [7], кукуруза [8], салат-латук [9] и томаты [10]. На огурце также было проведено множество исследований по разработке методик оценки листовой площади огурца в различных условиях. Так, Bozkurt и Keskin (2018) предложили уравнение прогнозирования площади листьев для различных уровней орошения [11]. Blanco и Folegatti(2005) в условиях различной солености и прививки для тепличных огурцов [12]. Cho и др. (2007) предложили уравнение прогнозирования изменения площади листьев с использованием длины, ширины листа, и значения уровня хлорофилла измеренного с помощью SPAD для огурцов, выращенных на гидропонике [13].

Материал и методы

Исследуемые растения выращивали в осеннем обороте на светокультуре (посев – 16.08.2022, посадка – 02.09.2022, первый сбор – 21.09.2022, ликвидация – 01.12.2022). Опыт проводили на 110 образцах гибридов F 1 селекции компании «Гавриш», в качестве контроля использовали гибриды иностранной селекции: F 1 Бьерн,

F 1 Валигора, F 1 Малахит, F 1 Муромец, F 1 Мева, F 1 Лоэнгрин. Растения выращивали в отапливаемых зимних остекленных теплицах на субстрате из минеральной ваты на шпалере с приспусканием, с использованием искусственного освещения (16 тыс. лк). На 1 м² располагали 2,4 растения, площадь учетной делянки – 2,5 м², расстояние между лотками 1,6-1,8 м, высота шпалеры на светокультуре 3,5 метра. Формирование растений вели в один стебель с приспусканием. На протяжении всей вегетации на растениях удаляли все боковые побеги, учеты проводили на главном побеге. Первый учет площади листьев проводили в фазу первого плодоношения растений 19.09.2022, второй учет – через 1,5 месяца после первого (08.11.2022).

На каждой делянке стандартно высаживали по 6 учетных растений, кроме того дополнительно на 30% делянок было высажено седьмое не учетное растение, которое предназначалось для удаления на разных этапах выращивания. С него срезали все листья, проводили измерения по каждому из них. Всего было обработано более 400 листьев, полностью все на 18 растениях. После создания математической модели для ее практического применения на каждой делянке описывали три растения из шести: обычно 1, 3 и 5. Если среди них было не типичное: с травмами, заломами, поражениями – его заменяли соседним. Одни и те же растения описывали в обоих учетах. Если какое-либо из них было травмировано в период между учетами, брали в работу соседнее. Среднее арифметическое параметров трех типичных растений на делянке использовали для вычисления площади листьев, характерное для данного генотипа.

Результаты исследований и их обсуждение

Первой задачей было определить способ точного измерения площади листа. Начали с весового метода. Для этого контур листа переносили на листовой материал (бумагу) с известной плотностью. Вырезали его и взвешивали. Далее вычислили, сколько весит каждый см². Использовали бумагу повышенной плотности: 1 дм² – 0,823 г или 1 см² – 8,2 мг. Точность наших аналитических весов (OHAUS PA214) составляла 0,1 мг, что соответствует площади в 0,012 см².

Следующим этапом оценили равномерность плотности бумаги по всей площади листа: Его разрезали на фрагменты по 120 см² с максимальной точностью ±0,2 мм. Перед взвешиванием их взаимно совместили, убедившись, что площади каждого точно совпадают друг с другом. Результаты представлены на рисунке 1: хорошо видно, что отклонения от среднего значения не превышают 2%.

1,01 1,00	1,00 1,00	1,01
		1,00
1,01	1,01	0,99
1,01	1,00	0,98
1,00	1,01 |	0,98
1,00	1,01	0,99
1,02	1,02	0,98
0,98	1,00	1,00

Рис.1. Относительная равномерность плотности бумаги для определения площади листьев. 1,00 = 823 мг/100 см Fig.1. Relative uniformity ofpaperdensity formeasuring leaf area. 1.00=823 mg/100 cm ²

Рис.2. Сканированные фрагменты листьев одного растения. Всего 26 листьев Fig. 2. Scanned fragments ofleaves ofone plant. 26 leaves in total

Поскольку каждый лист бумаги использовали для вырезания контура многократно (на большем контуре вырезали контур листа меньшего размера), учитывали возможную ситуацию, когда испарения из листа огурца пропитывают бумагу. При каждом переносе контура листа на бумагу под ним в центре помещали дополнительно контрольный листок из того же материала. Его взвешивали каждый раз перед взвешиванием очередного контура. Никаких достоверных изменений массы такого контроля даже при многократных повторах не обнаружили: лист растения не передавал влагу на бумагу в количествах, способных исказить получаемые данные.

Площадь листа рассчитывали по формуле:

S=m/P*100 (1);

где S – площадь листа в см², m – масса его бумажного контура в мг, P – плотность дм² (100 см²) в мг.

Например, масса бумажного контура в m=2,354 г соответствовала площади 286 см2 при плотности Р=823 мг/дм², или при m=4,956 г – площади 602 см².

Это относительно точный метод с ошибкой не более 2%, однако является довольно громоздким и трудоемким. Два человека обрабатывали 5 растений с общим количеством 130 листьев полный рабочий день. Поэтому испытали ещё и вариант со сканированием листьев на фото-сканере “EPSON Perfection V600 Photo”.

Сканирование проводили с параметрами: тип скана – «черно-белый»; разрешение – 100 dpi; размер окна 215,9х297,2 мм (полное по умолчанию). Полученные в формате «***.jpg» изображения, записывали в отдельную папку, с указанием даты сканирования, номера делянки и растения. Каждый лист нумеровали, и этот номер указывали в имени файла. Если размер листа выходил за рамки окна сканера, отрезали выступающие части и помещали их на свободное место. Если и этого оказывалось недостаточно, разрезали лист пополам и обе половинки его сканировали отдельно: скан фрагментов одного листа записывали в двух файлах: № «А» и № «В».

На рисунке 2 показаны результаты сканирования 26 листьев одного растения. Такой подход ускоряет работу в 2-2,5 раза по сравнению с весовым методом.

Получение числовых значений площади листа можно проводить в любом графическом редакторе, имеющем необходимые инструменты. Мы использовали «Adobe Photoshop CS3». Для этого создается новый файл с размером холста 215,9х297,2 мм, как окно сканера и с разрешением 100 пикселей/см. Туда с помощью инструмента «Перемещение» вставляется необходимый файл. Далее инструментом «Трансформирование» границы этого файла точно совмещаем с границами холста файла «Нового». Все черные контуры выделяем инструментом «Быстрое выделение». Во вкладке «Гистограмма» используем режим «Расширенный просмотр». В графе «Источник» выбираем «Выделенный слой». После этих шагов следует «Обновить данные». Наконец, в графе «Пиксели» указано количество пикселей в выделенном фрагменте. Если отбросить последние четыре цифры, получаем его площадь в см². При некотором опыте все эти операции вместе занимают всего 15-20 с – время определения площади одного листа.

На рисунке 3 видно, что оба метода практически полностью совпадают по сумме площадей всех листьев и по виду распределения площадей по растению. Все отклонения в сторону «+» полностью компенсированы отклонениями в сторону «-». Вычисленная с их помощью площадь каждого отдельного листа может отличаться до 12-15 см², что не превышает 2%.

Рис.3. Сравнение площади листьев одного и того же растения,определенных бумажно-весовым способом и анализом скана листа в графическом редакторе

Fig. 3. Comparison ofleaf areas of the same plantmeasuring by paper-weightmethod andby analysis ofleafscan into a graphic editor

Таким образом, использование сканера и графического редактора для определения площади листьев оказалось в 2-2,5 производительнее, чем бумажновесовой метод при одинаковой 98% точности. Поэтому все остальные измерения мы проводили только с помощью сканера.

Следующим этапом нашей работы было определение связи площади листа с его линейными размерами (рис. 4), минимизировать её возможные искажения.

Рис.4. Линейные параметры листа,измеряемые при определении его площади. W- ширина,L - длина,h -длина центральной жилки. Жёлтым отмечены реперные точки

Fig. 4. Linearparameters ofleaf,measured ofits area. W - is the width,L - is the length,h - is the length ofthe centralvein.