Прижизненное окрашивание живых объектов в ветеринарии

Прижизненное окрашивание (витальное окрашивание) – метод окрашивания живых клеток специальными красителями, применяемыми в нетоксических концентрациях. Проникая в клетки животных, одни красители диффузно окрашивают цитоплазму, другие красители откладываются в виде гранул в области комплекса Гольджи, оставляя ядро и цитоплазму неокрашенными. При повреждении клеток окрашивание диффузными красителями усиливается.

Красители, пригодные для прижизненного окрашивания, называются витальными. В отличие от многих других красителей, используемых в микроскопировании, они обладают двумя дополнительными свойствами: имеют низкую токсичность и обладают способностью легко проникать в живые клетки и их структуры через клеточные оболочки и цитоплазматические мембраны.

Материалы и методика исследования

Цель исследования: изучить жизнеспособность сперматозоидов у мышей линии – белые аутбредные сток CD-1.

Материалом для исследования послужили мыши линии – белые аутбредные сток CD-1, содержащиеся в виварии при Инновационном научно-исследовательском испытательном центре ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный Университет». Гистологическое исследование проводили на базе лаборатории патоморфологии ИНИИЦ. Для визуализации изображений применяли комплекс LiecaDM 5000 и систему обработки и анализа изображений LeicaQWin.

Для определения жизнеспособности сперматозоидов трипановую синь вводили

25 мышам. Для этой цели животных фиксировали корнцангом брюшком вверх (рис. 1).

Рисунок 1 – Фиксация крысы корнцангом

После обработки места введения спиртом осторожно прокалывали брюшную стенку по средней линии в нижней половине туловища и опускали шприц так, чтобы между ним и брюшной стенкой был очень острый угол, вводили иглу на 0,5-1 см в брюшную полость и инъецировали краситель. При таком положении иглы она не повреждает органы, расположенные в брюшной полости.

При этом методе хорошее окрашивание трипановой синью получилось уже через 2 суток после инъекции. Краситель хорошо удерживался в тканях, и результаты инъекции изучали на 3-7 день введения. При введении красителя в брюшную полость окрашивание тканей наступает несколько раньше, так как раствор быстрее всасывается в кровь и разносится по организму.

На предметное стекло полуавтоматической пипеткой с наконечником разового пользования наносили каплю тщательно размешанного эякулята. Объем капли был фиксированным и составил 10 мкл. Размер покровного стекла 22x22 мм. Под тяжестью покровного стекла эякулят равномерно и однослойно распределяли по поверхности предметного стекла, обеспечивая стандартную толщину около 20 мкм и оптимальный обзор препарата. В приготовленном препарате, между покровным и предметным стеклами, не должно быть пузырьков воздуха. Стабилизация препарата происходила в течение 1 мин. Исследование спермы проводили при постоянной температуре в лаборатории не ниже +20 °С, что обеспечило стабильные результаты при оценке подвижности сперматозоидов.

Результаты и их обсуждение

В норме у практически здоровых пациентов агглютинации сперматозоидов нет (рис. 2 А, Б).

Рисунок 2 – Здоровые сперматозоиды

А, Б – нормальные сперматозоиды. Препарат окрашен трипановой синью. Иммерсия х1000.

Агглютинация сперматозоидов – это склеивание подвижных сперматозоидов между собой головками, хвостами или головок с хвостами (рис. 3 А, Б).

Рисунок 3 – Агглютинация сперматозоидов

А – резко выраженная агглютинация.

Конгломерат сперматозоидов, «склеенных» хвостами. Иммерсия х400.

Б – резко выраженная агглютинация сперматозоидов хвостами.

Препарат, окрашенный трипановой синью. Иммерсия х1000.

Агглютинация позволяет предположить наличие иммунологического фактора бесплодия, однако ее нельзя считать доказательством последнего.

В бланке отмечаем тип агглютинации (головками, хвостами или смешанный вариант) и оценивали степень агглютинации полуколичественно:

"-" – отсутствие агглютинации;

• "+" – слабо выраженная – в нативном препарате до 10 кучек сперматозоидов по 4-6 в каждой;

• "++" – значительная агглютинация – в препарате более 20 кучек сперматозоидов по 4-8 в каждой;

• "+++" – резко выраженная – в препарате более 20 кучек, в каждой более 20 сперматозоидов;

"++++" – тяжелая степень – все подвижные сперматозоиды находятся в состоянии агглютинации.

Данные гистологической оценки жизнеспособности сперматозоидов показали, что в условиях вивария агглютинации сперматозоидов происходила у 5% мышей.

Выводы

На основании результатов, полученных при анализе гистологических препаратов, установлено, что у данных мышей линии – белые аутбредные сток CD-1 агглютинация сперматозоидов обнаружена в 5% случаев.