Процессы эндоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании мыши при экспериментальном сахарном диабете

Сахарный диабет (CД) – это эндокринное заболевание, характеризующееся повышением уровня сахара в крови вследствие абсолютного или относительного дефицита инсулина – гормона поджелудочной железы (Vincent et al, 2011). Оно вызывает функциональные и морфологические изменения в различных органах и тканях, включая нервную, сердечнососудистую и мышечную системы (Vincent et al., 2011). В ряде исследований были показаны морфологические и функциональные изменения нервно-мышечного синапса как на пре-, так и постсинаптическом уровнях, включающие как нарушения секреции медиатора, снижение экспрессии ацетилхолиновых рецепторов и ацетилхолинэстеразы, уменьшение числа синаптических везикул (Said, 2007).

Целью работы явилось исследование медленного массированного эндоцитоза в норме и при экспериментальном СД в диафрагмальной мышце мыши.

Материал и методы. Эксперименты проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах диафрагмальной мышцы лабораторных белых мышей. Для исследования процессов экзоцитоза синаптических везикул в двигательном нервном окончании использовали флуоресцентный маркер FM 1-43 (3 мкМ), который обратимо связывается с пресинаптической мембраной и во время эндоцито-за синаптических везикул оказывается внутри нервной терминали («загрузка» терминали). Регистрацию свечения нервных окончаний проводили с помощью микроскопа AxioScope A1 («Carl Zeiss», Германия), оснащенного быстродействующей черно-белой видеокамерой AxioCam MRm («Carl Zeiss», Германия). Все наблюдения проводили только на поверхностно-лежащих нервных окончаниях. Оценивали среднюю интенсивность свечения на участке нервной терминали длиной 10-20 мкм в относительных единицах (о.е.), оценивая свечение пикселя от 0 до 256. Для исследования роли медленного пути эндоцитоза синаптических везикул использовали блокатор гликоген синтаз киназы 3 (GSK3) – 1-azakenpaullone (фирма Sigma) в концентрации 2 мкМ.

Результаты исследования.

Показателем загрузки красителя в НО при эндоцитозе синаптических везикул являлось появление характерного свечения нервных терминалей. Для анализа интенсивности процессов эндоцитоза использовали три протокола «загрузки» красителя. У контрольных животных при добавлении FM 1-43 во время стимуляции (1 мин, 50 Гц) свечение нервных терминалей составило 85±3 о.е. (n=14); при добавлении красителя на 7 мин после окончания стимуляции – 56±2 о.е. (n=15); при добавлении на весь период во время стимуляции и после ее окончания – 87±3 о.е. (n=13). У животных с экспериментальным СД происходило усиление свечения нервных терминалей при всех протоколах «загрузки» красителя: 99±3 о.е. (n=10, n<0,05), 65±2 о.е. (n=7, n<0,05) и 96±2 о.е. (n=8, n<0,05), соответственно.

Известно, что в нервном окончании мыши при высокочастотной стимуляции наблюдается преобладание быстрого эндоцитоза над медленным (Betz, Angelson, 1998). Недавние исследования показали, что GSK3 является существенным фактором для запуска медленного пути эндоцитоза в результате рефосфорилирования динамина 1 (Clayton et al., 2010). Оказалось, что предварительная инкубация нервно-мышечного препарата в блокаторе GSK3 -1-azakenpaullone не влияла на свечение нервных терминалей в контроле (81±4 о.е., n=5), тогда как в условиях экспериментального СД происходило снижение свечения нервных терминалей до 65±2 о.е., (n=6, p<0,05).

Таким образом, в нервных окончаниях мышей с моделью СД происходит усиление процессов эндоцитоза синаптических везикул, и этот феномен предотвращается при блокировании GSK3.