Продукты выщелачивания в бактериальной системе "порода-культура" при биохимической деградации силикатными бактериями диатомита, цеолита и бентонита

почвенный раствор обогащается ионами и лигандами элементов, принимающих участие, как в элементарных почвенных процессах, так и в формировании свойств естественного плодородия гумусоаккумулятивного горизонта [15-19].

Новизна и цель исследования. В практике почвоведения, к сожалению, пока недостаточно сведений о прямом участии некоторых родов почвообитающих микроорганизмов в деградации веществ, используемых в качестве удобрений и почвенных кондиционеров [14, 20]. В том числе данный пробел имеется и в отношении эффектов от прямого (без участия собственно почвенного вещества) биохимического воздействия силикатных бактерий, выделенных из конкретных природных биогеоценозов, на вещество высококремнистых пород – диатомита, цеолита и бентонитовой глины.

Цель работы: раскрытие потенциального действия накопительной природной культуры силикатных бактерий, а также чистой культуры Bacillus Mucilaginosus , выделенных из дерновоподзолистой легкосуглинистой почвы Нижегородской области, на вещество природных кремнийсодержащих пород, которые используются в наших полевых исследованиях в качестве удобрений и почвенных кондиционеров.

Объекты и методы исследований. Исследования проводились в 2017 г. на базе научнообразовательного центра «Биотехнология» и лабораторного комплекса «Эколого-аналитическая лаборатория мониторинга и защиты окружающей среды» Мининского университета в виде серии постановочных лабораторных экспериментов с природными кремнийсодержащими породами. Данные материалы подвергались микробиологической деградации чистой культурой Bacillus Mucilagi-nosus и накопительной культурой комплекса силикатных бактерий, выделенных из дерново-подзолистой легкосуглинистой почвы природного биогеоценоза (лесной массив Борского района Нижегородской области).

Объектами исследований являются кремнийсодержащие породы – диатомит Инзенского месторождения (Ульяновская область), цеолит Хотынец-кого месторождения (Орловская область) и бентонитовая глина Зырянского месторождения (Курганская область), обобщенный химический состав которых представлен в табл. 1.

Таблица 1. Обобщенный химический состав высококремнистых пород

Порода	ИЕ*	Элемент в оксидной форме (на абс.-сух. вещество)
		SiO 2	P 2 O 5	K 2 O	CaO	MgO
Диатомит	80
- валовая форма, %		83,1	0,05	1,25	0,52	0,48
- подвижная форма, мг/кг		12200	37	350	10	39
Цеолит	48
- валовая форма, %		56,6	0,23	1,82	13,3	1,90
- подвижная форма, мг/кг		7950	260	250	4800	1600
Бентонит	150
- валовая форма, %		52,3	0,12	0,92	5,5	3,2
- подвижная форма, мг/кг		10500	165	87	46,1	14,2

Примечание: * – ионообменная емкость, мг-экв./100 г

Накопительную культуру комплекса силикатных бактерий получали путем засева стерильной жидкой питательной среды Александрова-Зака (САЗ) навеской подготовленной почвы и культивирования бактериальной биомассы в термостате в течение 7 суток при температуре +26ºС. Чистую природную культуру Bac. Mucilaginosus получали аналогичным способом в виде двойного пересева идентифицированных клеток на селективной жидкой питательной среде Няниковой-Виноградова (СНВ) [21]. Для сравнения биохимической активности природной клетки Bac. Mucilaginosus использовали условный эталон – аналогичную бактерию штамма В-2609, лиофилизат которого был закуплен во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»). Первичная биомасса данного штамма была получена аналогичным с природными клетками образом при его двукратном культивировании на L-среде (СЛ) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Затем производился засев испытуемых пород полученными бактериальными комплексами. Опыты ставили в стерильных конических колбах на 100 мл, в которые асептически помещалось по 40 мл селективной жидкой питательной среды и точно по 1,000 г высушенной кремнийсодержащей породы, после чего полученная система асептически засевалась 10 мл суспензии 7-и суточной накопительной культуры силикатных бактерий, а также чистой культуры природного и штаммового вариантов Bac. Mucilagi-nosus. В качестве контроля для каждой системы «порода-культура» использовалась стерильная питательная среда с навеской стерильной породы без засева бактериями. На основании данных, полученных с контрольных колб, оценивалась химическая минерализация кремниевых материалов под действием температуры, воды и компонентов питательных сред.

Засеянные колбы помещались в термостат и культивировались при +26ºС в течение 30 суток; 2 раза в сутки содержимое колб встряхивалось в течение 1-го часа. Через определенные интервалы времени (на 1, 3, 5, 7, 10, 12, 15, 20, 25 и 30 день) производили химические замеры содержимого колб. В системе «порода-культура» определялась кислотность микробной суспензии потенциометрическим методом с помощью рН-метра МАРК-903; содержание растворимых соединений фосфора и кремния спектрофотометрическим методом; содержание растворимого кальция определялось комплексонометрическим титрованием с трилоном Б по традиционным химико-аналитическим прописям [22]. Математическая обработка результатов исследований выполнена методами вариационной статистики с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel 2007; повторность в опытах четырехкратная.

Результаты исследований. На рис. 1 представлена 30-дневная динамика содержания в системе «порода-культура» растворимых фосфатов при минерализации высококремнистых пород в зависимости от чистой природной культуры и штамма В-2609 Bacillus Mucilaginosus , принятого за условный эталон.

Нужно сказать, что чистая культура Bac. Muci-laginosus , выделенная из дерново-подзолистой почвы, в течение всей экспозиции эксперимента в большей степени способствовала выщелачиванию фосфатов из бентонитовой глины. В этой системе содержание растворимого фосфора колебалось от 5,3 до 67,3 мкг/мл. В немного меньшей мере культура силикатных бацилл способствовала высвобождению фосфатов из диатомовой породы – от 10,6 до

56,8 мкг/мл, а их минимальная биохимическая активность прослеживалась в отношении цеолита – от 8,2 до 43,6 мкг/мл. Штамм В-2609 исследуемой Bac. Mucilaginosus характеризовался гораздо более высокой биохимической активностью в части выщелачивания фосфора из всех пород. Так, на варианте с диатомитом наибольшее количество фосфатов в бактериальной суспензии составило 119,0 мкг/мл, на варианте с цеолитом – 105,4 мкг/мл, а на варианте с бентонитовой глиной – 118,9 мкг/мл. Примечательно также отметить, что наибольшая микробная активность данных бактерий была отмечена на 12-й день экспозиции системы «порода-культура». Рис. 2 характеризует содержание растворимых силикатов в системе «порода-культура» при динамической деградации высококремнистых пород изучаемыми культурами Bacillus Mucilaginosus .

Нужно сказать, что чистая культура Bac. Muci-laginosus , выделенная из дерново-подзолистой почвы, в течение всей экспозиции эксперимента в большей степени способствовала выщелачиванию фосфатов из бентонитовой глины. В этой системе содержание растворимого фосфора колебалось от 5,3 до 67,3 мкг/мл. В немного меньшей мере культура силикатных бацилл способствовала высвобождению фосфатов из диатомовой породы – от 10,6 до 56,8 мкг/мл, а их минимальная биохимическая активность прослеживалась в отношении цеолита – от 8,2 до 43,6 мкг/мл. Штамм В-2609 исследуемой Bac. Mucilaginosus характеризовался гораздо более высокой биохимической активностью в части выщелачивания фосфора из всех пород. Так, на варианте с диатомитом наибольшее количество фосфатов в бактериальной суспензии составило 119,0 мкг/мл, на варианте с цеолитом – 105,4 мкг/мл, а на варианте с бентонитовой глиной – 118,9 мкг/мл. Примечательно также отметить, что наибольшая микробная активность данных бактерий была отмечена на 12-й день экспозиции системы «порода-культура». Рис. 2 характеризует содержание растворимых силикатов в системе «порода-культура» при динамической деградации высококремнистых пород изучаемыми культурами Bacillus Mucilaginosus .

Нужно сказать, что чистая культура Bac. Muci-laginosus, выделенная из дерново-подзолистой почвы, в течение всей экспозиции эксперимента в большей степени способствовала выщелачиванию фосфатов из бентонитовой глины. В этой системе содержание растворимого фосфора колебалось от 5,3 до 67,3 мкг/мл. В немного меньшей мере культура силикатных бацилл способствовала высвобождению фосфатов из диатомовой породы – от 10,6 до 56,8 мкг/мл, а их минимальная биохимическая активность прослеживалась в отношении цеолита – от 8,2 до 43,6 мкг/мл. Штамм В-2609 исследуемой Bac. Mucilaginosus характеризовался гораздо более высокой биохимической активностью в части выщелачивания фосфора из всех пород. Так, на варианте с диатомитом наибольшее количество фосфатов в бактериальной суспензии составило 119,0 мкг/мл, на варианте с цеолитом – 105,4 мкг/мл, а на варианте с бентонитовой глиной – 118,9 мкг/мл. Примечательно также отметить, что наибольшая микробная активность данных бактерий была отмечена на 12-й день экспозиции системы «порода-культура». Рис. 2 характеризует содержание растворимых силикатов в системе «порода-культура» при динамической деградации высококремнистых пород изучаемыми культурами Bacillus Mucilaginosus.

Нужно сказать, что чистая культура Bac. Muci-laginosus , выделенная из дерново-подзолистой почвы, в течение всей экспозиции эксперимента в большей степени способствовала выщелачиванию фосфатов из бентонитовой глины. В этой системе содержание растворимого фосфора колебалось от 5,3 до 67,3 мкг/мл. В немного меньшей мере культура силикатных бацилл способствовала высвобождению фосфатов из диатомовой породы – от 10,6 до 56,8 мкг/мл, а их минимальная биохимическая активность прослеживалась в отношении цеолита – от 8,2 до 43,6 мкг/мл. Штамм В-2609 исследуемой Bac. Mucilaginosus характеризовался гораздо более высокой биохимической активностью в части выщелачивания фосфора из всех пород. Так, на варианте с диатомитом наибольшее количество фосфатов в бактериальной суспензии составило 119,0 мкг/мл, на варианте с цеолитом – 105,4 мкг/мл, а на варианте с бентонитовой глиной – 118,9 мкг/мл. Примечательно также отметить, что наибольшая микробная активность данных бактерий была отмечена на 12-й день экспозиции системы «порода-культура». Рис. 2 характеризует содержание растворимых силикатов в системе «порода-культура» при динамической деградации высококремнистых пород изучаемыми культурами Bacillus Mucilaginosus .

Нужно сказать, что чистая культура Bac. Muci-laginosus , выделенная из дерново-подзолистой почвы, в течение всей экспозиции эксперимента в большей степени способствовала выщелачиванию фосфатов из бентонитовой глины. В этой системе содержание растворимого фосфора колебалось от 5,3 до 67,3 мкг/мл. В немного меньшей мере культура силикатных бацилл способствовала высвобождению фосфатов из диатомовой породы – от 10,6 до 56,8 мкг/мл, а их минимальная биохимическая активность прослеживалась в отношении цеолита – от 8,2 до 43,6 мкг/мл. Штамм В-2609 исследуемой Bac. Mucilaginosus характеризовался гораздо более высокой биохимической активностью в части выщелачивания фосфора из всех пород. Так, на варианте с диатомитом наибольшее количество фосфатов в бактериальной суспензии составило 119,0 мкг/мл, на варианте с цеолитом – 105,4 мкг/мл, а на варианте с бентонитовой глиной – 118,9 мкг/мл. Примечательно также отметить, что наибольшая микробная активность данных бактерий была отмечена на 12-й день экспозиции системы «порода-культура». Рис. 2 характеризует содержание растворимых силикатов в системе «порода-культура» при динамической деградации высококремнистых пород изучаемыми культурами Bacillus Mucilaginosus .

Рис. 1. Динамика чистого микробного выщелачивания фосфора при деградации кремнийсодержащих пород природной культурой (СНВ) и штаммом В-2609 Bacillus Mucilaginosus (СЛ)

SiO2 Д-снв SiO2 Ц-снв ^м SiO2 Б-снв л SiO2 Д-сл SiO2 Ц-сл SiO2 Б-сл

Рис. 2. Динамика чистого микробного выщелачивания кремния при деградации кремнийсодержащих пород природной культурой (СНВ) и штаммом В-2609 Bacillus Mucilaginosus (СЛ)

В целом во всех экспериментах было установлено, что помимо активного бактериального выщелачивания из пород таких элементов как фосфор и кальций деятельность Bac. Mucilaginosus в большей степени затрагивала процесс высвобождения в раствор из пород кремния. Так, уже на 5-й день после засева почвенной культурой питательной среды с диатомитом содержание растворимого кремния в системе «порода-культура» составляло 2,46±0,03 мг/мл (V=2,1%); на варианте с цеолитом данное значение составляло 2,73±0,03 мг/мл (V=2,5%), а на варианте с бентонитом оно было наибольшим – 3,85±0,04 мг/мл (V=2,1%). На 10-й день культивирования значения составили уже 5,84±0,09 мг/мл (V=3,0%), 7,62±0,07 мг/мл (V=1,9%) и 7,05±0,09 мг/мл (V=2,5%) соответственно на вариантах с диатомовой, цеолитовой и бентонитовой породами.

Штамм В-2609 бактерии Bac. Mucilaginosus , принятый в качестве условного эталона основной функции биохимической деградации высококремнистых пород и выщелачивания кремния в раствор, на 5-й и 10-й день культивирования активно способствовал высвобождению кремния в раствор системы «порода-культура» в количествах, равных 9,84±0,13 мг/мл (V=2,6%) и 15,41±0,41 мг/мл (V=5,3%)

из диатомита; 9,31±0,14 мг/мл (V=2,9%) и 12,83±0,27 мг/мл (V=4,2%) из цеолита; 9,45±0,08 мг/мл (V=1,8%) и 13,95±0,19 мг/мл (V=2,8%) из бентонитовой глины. Однако при дальнейшем культивировании бактериальных суспензий выщелачивание кремния резко возрастало вплоть до 25-го дня на вариантах с природной культурой бацилл и до 20-го дня на вариантах со штаммом В-2609. При этом в зависимости от породы сила выщелачивания силикатов была различной. Например, в части деградации диатомита природная культура Bac. Mucilaginosus и штамм В-2609 практически не отличались биохимической активностью – на 20-й и 25-й день содержание SiO 2 в суспензиях составляло 86,95-88,40 мг/мл. Однако на варианте с цеолитом и бентонитовой породой данные значения составили 68,53 и 85,16 мг/мл и 106,60 и 158,02 мг/мл. Очевидно, что для Bac. Muci-laginosus штамма В-2609 цеолит и бентонитовая глина в большей степени доступны для выщелачивания силикатов в раствор в сравнении с природной культурой бактерии. На рис. 3 показана 30-дневная динамика содержания в системе «порода-культура» растворимых соединений кальция при минерализации высококремнистых пород изучаемыми культурами Bacillus Mucilaginosus .

11=1 CaО Д-снв CaО Ц-снв ^™ CaО Б-снв A CaО Д-сл CaО Ц-сл —•— CaО Б-сл

Рис. 3. Динамика чистого микробного выщелачивания кальция при деградации кремнийсодержащих пород природной культурой (СНВ) и штаммом В-2609 Bacillus Mucilaginosus (СЛ)

Нужно отметить, что чистая культура Bac. Mucilaginosus, выделенная из дерново-подзолистой почвы, в течение всей экспозиции эксперимента в большей степени способствовала выщелачиванию кальция из цеолита. В данной системе содержание растворимого кальция колебалось от 1,03 до 24,86 мг/мл. В меньшей мере культура силикатных бацилл способствовала высвобождению CaO из бентонитовой породы – от 0,81 до 10,92 мг/мл, а их минимальная биохимическая активность прослеживалась в отношении диатомита – от 0,02 до 4,32 мг/мл. Однако штамм В-2609 исследуемой Bac. Mucilagi-nosus, хоть и характеризовался более высокой биохимической активностью в части выщелачивания кальция, но в меньшей силе в сравнении с высвобождением фосфатов и только в отношении диатомита и бентонитовой глины. Так, на варианте с диатомитом наибольшее количество растворенного кальция в бактериальной суспензии составило 4,36 мг/мл на 12-й день, на варианте с бентонитом – 29,19 мг/мл на 15-й день и 31,82 мг/мл на 30-й день. На варианте с цеолитом содержание CaO в суспензии оказалось наименьшим и составило 2,93-3,00 мг/мл на конец экспозиции эксперимента. Примечательно также отметить, что микробная активность данных бактерий показывала двойные пики, которые были отмечены на 12-й и 15-й, а также на 25-й и 30-й дни экспозиции системы «порода- культура». Рис. 4 описывает содержание растворимых соединений фосфора и кальция в системе «порода-культура» при динамической деградации высококремнистых пород накопительной культурой комплекса силикатных бактерий из дерновоподзолистой почвы.

Микробная активность высвобождения фосфатов от комплекса силикатных бактерий показывала двойные пики на варианте с диатомитом и цеолитом – до 43,6 и 77,3 мкг/мл соответственно на 12-й и 25-й день в отношении диатомита и до 112,6 и 157,1 мг/мл соответственно на 12-й и 20-й день в отношении цеолита. На варианте с бентонитовой глиной максимальная концентрация растворенных фосфатов в системе отмечалась на 15-й день и составила 54,2 мкг/мл.

В части биохимического выщелачивания соединений кальция в систему «порода-культура» от действия комплекса силикатных бактерий на среде Александрова-Зака нужно сказать, что, как и в случае с чистыми культурами Bac. Mucilaginosus , рассматриваемые микроорганизмы в большей степени способствовали высвобождению элемента из цеолитовой породы. Здесь наибольшее накопление CaO в суспензии отмечалось на 12-й день и составило 32,96 мг/мл, в то время как на варианте с диатомитом – 12,79 мг/мл, а на варианте с бентонитовой глиной – 14,82 мг/мл.

| 1=1 Р2О5 Д-саз Р2О5 Ц-саз ^™ Р2О5 Б-саз A CaО Д-саз CaО Ц-саз CaО Б-саз

Рис. 4. Динамика чистого микробного выщелачивания фосфора и кальция при деградации кремнийсодержащих пород накопительной культурой комплекса силикатных бактерий (САЗ)

—±_ SiO2 Д-саз       SiO2 Ц-саз       SiO2 Б-саз

Рис. 5. Динамика чистого микробного выщелачивания кремния при деградации кремнийсодержащих пород накопительной культурой комплекса силикатных бактерий (САЗ)

На рис. 5 представлена 30-дневная динамика содержания в системе «порода-культура» растворимых силикатов при минерализации высококремнистых пород накопительной культурой силикатных бактерий. В варианте с диатомовой и цеолитовой породами содержание растворенного кремния в суспензии равномерно увеличивалось до 12-го дня, после чего оставалось примерно на одном уровне – в диапазоне 269,8-410,9 мг/мл в отношении диатомита и в диапазоне 369,6-392,3 мг/мл в отношении цеолита. Система с бентонитом характеризовалась наличием пика концентрации растворенных силикатов на 15-й день культивирования, которая составила 681,3 мг/мл, который из всех рассмотренных вариантов с породами был самым наибольшим.

Известно [23-24], что биохимическая деятельность бактерий сопровождается выделением в окружающую среду разнообразных метаболитов органического состава – ферменты, полисахариды, липиды, органические кислоты и многие другие вещества. Данными свойствами обладают, в том числе и почвообитающие силикатные бактерии [3, 21, 25-26]. В результате выполнения ими основных функций по деструкции первичных и вторичных минералов почвы в почвенный раствор выделяется большое количество органических кислот и полисахаридов, которые обладают кислой реакцией среды и способны влиять на рН системы на микроколиче-ственном уровне. В табл. 2 показана 30-дневная динамика кислотности системы «порода-культура» в зависимости от изучаемого кремнийсодержащего материала и вида силикатных бактерий.

Таблица 2. Динамика кислотности системы «порода-культура» из кремнийсодержащих пород и различных силикатных бактерий

рН,	День учета кислотности
ед. рН	1 1	3 1	5 1	7 1	10 1	12 1	15 1	20 1	25 1	30
Bacillus Mucilaginosus , природная чистая культура (среда Няниковой-Виноградова)
Диатомит	3,92	4,63	4,81	4,80	4,79	4,62	4,90	5,10	6,23	7,10
Цеолит	4,02	4,13	4,39	4,23	4,26	4,29	4,30	4,32	4,33	4,55
Бентонит	4,85	5,10	5,33	5,38	6,41	6,18	6,77	7,13	7,59	8,01
Bacillus Mucilaginosus , штамм В-2609 (L-среда)
Диатомит	8,45	8,56	8,71	8,58	8,63	8,76	8,94	9,02	8,87	8,79
Цеолит	8,53	8,62	8,80	8,74	8,63	8,55	8,78	8,95	8,74	8,56
Бентонит	8,60	8,76	8,81	8,72	8,70	8,54	8,79	9,08	8,99	8,85
Нкультура комплекса силикатных бактерий (среда Александрова-Зака)
Диатомит	4,60	4,70	4,97	4,73	4,59	5,18	4,36	4,19	4,17	4,21
Цеолит	4,63	5,11	5,02	4,88	4,66	4,51	4,44	4,32	4,47	4,57
Бентонит	5,26	5,83	6,39	6,04	5,17	5,99	4,84	4,68	4,71	4,82

Нужно отметить, что вариант с бентонитовой глиной в случае всех действующих на нее микроорганизмов характеризовался наибольшим значением рН в сравнении с вариантом с диатомовой и цеолитовой породой, что, по-видимому, могло быть связано с исходными характеристиками самого бентонита. Пики максимального увеличения рН систем приходились, как правило, на 5-й и 12-й день экспозиции, а также на ее конец (20-й и 30-й день), что, очевидно, могло быть связано как с колебанием численности живых клеток и, как следствие, с метаболизмом в систему продуктов жизнедеятельности, в том числе экзоферментов, полисахаридов и различных органических кислот. Кроме того, по данным табл. 2 видно, что кислотность всех систем стремилась в сторону нейтрального и слабощелочного диапазонов, что, очевидно, связано с растворением Ca- и Mg-содержащих микроструктур исследуемых материалов [27]. В связи с этим можно предположить, что рассмотренная выше динамика содержания растворимых соединений фосфора, кремния и кальция в системах «порода-культура» могла быть сопряжена не только с прямым действием метаболитов на вещество пород, но в том числе и с образованием нерастворимых оснований, а также фосфатов и карбонатов металлов, последние из которых изначально присутствуют как в составе питательных сред, так и в веществе пород.

Выводы: описана способность силикатных бактерий (в том числе Bacillus Mucilaginosus ), выделенных из дерново-подзолистой легкосуглинистой почвы Нижегородской области, проводить минерализацию кремнийсодержащих материалов (диатомит Инзенского месторождения, цеолит Хотынец-кого месторождения, бентонит Зырянского месторождения) с высвобождением в растворимое состояние фосфатов, силикатов и кальция. Из цеолита высвобождается наибольшее количество кальция (до 24,86 мг/мл и до 32,96 мг/мл) и фосфора (до 157,1 мкг/мл) при биохимическом участии чистой природной культуры Bac. Mucilaginosus и накопительной культуры силикатных бактерий соответственно. При биохимической деградации чистой культурой Bac. Mucilaginosus и комплексом силикатных бактерий бентонитовой глины высвобождаются максимальные концентрации фосфора (до 67,3 мкг/мл) и кремния (до 106,60 мг/мл и до 681,3 мг/мл). Бактериальное разрушение диатомовой породы, в первую очередь, сопровождается растворением фосфатов (до 56,8 мкг/мл) и силикатов (до 88,40 мг/мл) от действия соответственно природной культуры Bac. Mucilaginosus и накопительной культуры силикатных бактерий. Таким образом, на основании прямого воздействия метаболизма различных силикатных микроорганизмов, выделенных из почвы, на вещество природных высококремнистых материалов можно говорить об их активном участии в деградации последних при их внесении в почву с последующим высвобождением в почвенный раствор различных элементов.