Профили экспрессии микроРНК в лейкоцитах крови как маркеры тяжести расстройств аутистического спектра у детей

Расстройства аутистического спектра (РАС) относятся к нарушениям нейроразвития, для которых характерна клиническая и генетическая гетерогенность. Базовые симптомы РАС: недостаточность многих социальных функций, стереотипия и ограниченные интересы, появляются в раннем детстве и прогрессируют в течение взрослой жизни [Eissa et al., 2020].

Этиология РАС неизвестна. Однако, по мнению ряда авторов, она является результатом комплексных взаимодействий и комбинаций генетических аберраций с влиянием факторов окружающей среды. Среди последних значимую роль играет активация иммунитета матери на ранних сроках беременности в результате инфекции [Liu X. et al., 2023]. В соответствии с этой теорией, иммунная система матери изменяет фетальное окружение плода на воспалительное, что вносит вклад в нарушение сетевых взаимодействий в мозге у потомства матерей с активацией иммунной системы. В дальнейшем это находит отражение в дезорганизации когнитивного развития, аберрациях в активности мозга у потомства и может приводить к психическим нарушениям, включая РАС и шизофрению [Белокоскова и др., 2023; Brown et al., 2014; Bilbo, 2009]. Вместе с тем, пре/перинатальное воспаление в центральной нервной системе (ЦНС) создает условия для формирования хронического воспаления на периферии, которое сохраняется при РАС в течение жизни [Hu et al., 2018]. На сегодня известно, что нейровоспаление опосредовано сложным взаимодействием между клетками ЦНС и периферическими клетками иммунной системы. Одними из ключевых регуляторов этих взаимодействий выступают микроРНК [Slota, Booth, 2019].

МикроРНК относятся к классу малых некодирующих РНК, основными функциями которых являются регулирование экспрессии матричных РНК (мРНК), дестабилизация и регулирование уровней протеинов [Powdrill et al., 2016]. Изменяя локальную генную экспрессию, микроРНК способны контролировать функции клеток, в том числе клеток мозга: нейрогенез, миграцию, нейронную поляризацию, развитие синапса и синаптическую пластичность. Показано, что микроРНК играют важную роль в этиологии и/или поддержании неврологических и иммунных нарушений, а также путей коммуникации иммунной и нервной систем [Foller, Cremer, Béclin, 2014]. На сегодняшний день наиболее важными и хорошо изученными микроРНК в контексте нейровоспаления являются микроРНК-155, микроРНК-146а, микроРНК124, микроРНК-21 и микроРНК-9. Все они демонстрируют совокупные модулирующие эффекты на иммунную и нервную системы через прямые и непрямые изменения сигналов воспалительных путей [Slota, Booth, 2019; Soreq, Wolf, 2011]. Однако экспрессия этих микроРНК в клетках крови (лейкоцитах) у лиц с РАС изучена недостаточно. Кроме того, остается вопрос, могут ли уровни экспрессии микроРНК в лейкоцитах периферической крови использоваться как персональные биомаркеры в диагностике РАС и степени их тяжести [Бурмистрова и др., 2022].

Цель данной работы – выявление взаимосвязи уровней лейкоцитарной экспрессии микроРНК: микроРНК-155, микроРНК-146а, микроРНК-124, микроРНК-21 и микроРНК-9, с концентрацией цитокинов в плазме крови у детей с РАС для поиска биологических маркеров заболевания и степени его тяжести.

Материал и методика

Дизайн исследования

Исследования выполнены на базе научной лаборатории Инновационных биотехнологий биологического факультета ФГБОУ ВО ЧелГУ. Отбор участников исследования проводился психотерапевтами в рамках Соглашения о сотрудничестве № 92 от 16.04.2016 г. с Комитетом социальной политики города Челябинска и МБУ СО Социально-реабилитационным центром Здоровье.

В исследование включено 126 детей, проживающих в г. Челябинске. Основная группа – 81 ребенок с диагностированными РАС различной степени тяжести: 51 ребенок – c легким течением РАС, 30 детей – с тяжелым течением РАС. Диагноз РАС поставлен психотерапевтами реабилитационного центра Здоровье на основании МКБ-10. Степень тяжести аутизма определяли с помощью рейтинговой шкалы детского аутизма (Childhood Autism Rating Scale, CARS). Группа сравнения («Нормотипичное развитие») – 45 детей, посещающих детские дошкольные учреждения и школы пос. Первомайский Челябинской обл.

Этическая экспертиза

В рамках работы было получено информированное согласие на проведение комплексного обследования и обработку персональных данных. Исследование одобрено этическим комитетом Челябинского государственного университета (протокол № 2 от 27.08.2019 г.) и выполнено с учетом положения Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2013) [Бурмистрова и др., 2022].

Методы

Материалом для исследования служили лейкоциты периферической крови. Фракцию клеток получали из венозной крови с К 3 ЭДТА центрифугированием в течение 10 мин. при 3000 об/мин, с последующим лизированием осадка эритроцитов раствором NH 4 Cl [Бурмистрова и др., 2022].

В лейкоцитах периферической крови была проведена оценка уровней экспрессии: микроРНК-9, микроРНК-21, микроРНК-124-3p, микроРНК-146а-5p и микроРНК-155. Общую РНК выделяли фенолхлороформным методом с помощью реагента TRIZol («TermoFisher Scientific», США). Концентрацию и чистоту выделения РНК анализировали на флуориметре Quantus («Promega», США). Реакцию обратной транскрипции (ОТ) микроРНК в кДНК и полимеразную цепную реакцию в реальном времени (ПЦР-РВ) проводили наборами реагентов: «ОТ-1» и «Набор реагентов для проведения ПЦР‑РВ с SYBR Green» НПК «Синтол» (Россия), согласно инструкциям производителей, на приборной базе ДТ-прайм («ДНК-технология», Россия) [Бурмистрова и др., 2022]. Экспрессию генов-мишеней нормализовали по «гену домашнего хозяйства» – гену малой ядерной РНК (U6). Первичные нуклеотидные последовательности праймеров по типу «стебель-петля» для ОТ и праймеров для ПЦР-РВ синтезированы НПК «Синтол» согласно данным: микроРНК-9 – Tavakolian S. с соавторами [Tavakolian et al., 2020]; микроРНК-21 – Xu с соавторами [Xu et al., 2012]; микроРНК-124-3p – Liu Y.X. с соавторами [Liu Y.X. et al., 2016]; микроРНК-146а-5p – Zhang R.X. с соавторами [Zhang et al., 2017]; микроРНК-155 и U6, а также параметры программ ОТ и ПЦР-РВ – Yang L.H. с соавторами [Yang et al., 2014]. Уровень мРНК рассчитывали в относительных единицах по методу 2(-ΔΔCT) с учетом эффективности реакции [Livak, Schmittgen, 2001].

Статистический анализ

Статистическая обработка данных выполнена в программах: PAST (v. 3.15) и MedCalc (v. 10.2.0), графические построения выполнены в пакете «corrplot» программно-статистической среды R (v. 3.6.1). Нормальность распределения величин в выборке оценивали по критерию Колмогорова–Смирнова. Данные имели непараметрическое распределение. Для приведения значений к нормальному распределению была проведена трансформация Бокса-Кокса. Такой подход дает возможность выявить более «тонкие» различия между группами, т.к. анализу подвергаются как непосредственные значения, так и относительные расстояния между показателями на линейной шкале, тогда как в рамках порядковой статистики рассматриваются не сами значения, а их ранги и нелинейная шкала не позволяет учесть разницу расстояний. После наивной ретрансформации для каждого показателя рассчитывали средние значения и 95% доверительный интервал (ДИ). Для сравнения выборок применяли однофакторный дисперсионный анализ (one way ANOVA) с апостериорными попарными сравнениями по методу Фримана-Тьюки [Филиппова, Алексеева, Бурмистрова, 2023]. Корреляции между уровнями экспрессии микроРНК в лейкоцитах периферической крови и концентрацией цитокинов в плазме оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена отдельно для каждой исследуемой группы, и визуализировали в виде тепловой карты корреляций. Для оценки диагностической значимости микроРНК в качестве потенциальных маркеров аутизма и его тяжести использовали ROC-анализ, с вычислением площади под ROC-кривой и «точки отсечения». Во всех случаях эффекты считали статистически значимыми при P ≤0,05.

Результаты и обсуждение

Проведено клиническое и лабораторное обследование 45 детей с нормотипичным развитием и 81 ребенка с РАС. Группы детей были сопоставимы по полу (соотношение мальчики:девочки – 4:1). Возраст детей обеих групп варьировал в диапазоне от 3 до 13 лет, тем не менее, медианный возраст детей с нормотипичным развитием (9.0 лет) был значимо выше медианного возраста детей с РАС (6.0 лет). Значимых различий в уровнях экспрессии изученных микроРНК при делении детей согласно возрастной периодизации по ВОЗ (до 6 лет, 7–12 и 13 лет и старше) не обнаружено. Дети с РАС в зависимости от тяжести состояния (согласно CARS) были разделены психотерапевтами на группы с легким (баллы по CARS 29– 36) и тяжелым течением (баллы по CARS 36–60).

Экспрессию микроРНК: микроРНК-155, микроРНК-146а, микроРНК-124, микроРНК-21 и микроРНК9 оценивали в лейкоцитах периферической крови детей с легким/тяжелым течением РАС и нормотипичным развитием. Данные представлены в таблице.

Обнаружено: 1. Уровни экспрессии микроРНК в лейкоцитах крови детей с легким течением РАС не отличались от значений детей с нормотипичным развитием; 2. У детей с тяжелым течением РАС в лейкоцитах периферической крови была значимо снижена экспрессия микроРНК-124, по сравнению с аналогичным показателем группы «Нормотипичное развитие», и микроРНК-146а – как по отношению к значениям нормотипичных детей, так и детей группы «Легкое течение РАС» (таблица).

Уровни экспрессии микроРНК в лейкоцитах у детей с легким течением РАС, тяжелым течением РАС и нормотипичным развитием, M [95%ДИ]

[MicroRNA expression levels in leukocytes of children with a mild ASD, severe ASD and normotypical development, M [95% CI]]

Показатели, у.е.	Нормотипичное развитие n = 45	Легкое течение РАС n = 51	Тяжелое течение РАС n = 30
Возраст, лет	9.0 [4.0-13.0]	6.0 [3.0-13.0]	6.0 [3.0-13.0]
Баллы по CARS	-	32.0 [29.0-36.0]	40.0 [37.0-55.0]
МикроРНК-9	0.54 [0.36; 0.77]	0.55 [0.41; 0.73]	0.49 [0.34; 0.71]
МикроРНК-21	0.12 [0.08; 0.16]	0.13 [0.10; 0.16]	0.12 [0.08; 0.16]
МикроРНК-124	0.13 [0.10; 0.18]	0.13 [0.11; 0.17]	0.09 [0.07; 0.13] P 3-1 =0.049
МикроРНК-146a	0.008 [0.005; 0.012]	0.006 [0.004; 0.008]	0.004 [0.002; 0.006] P 3-1 <0.001 P 3-2 =0.002
МикроРНК-155	0.002 [0.002; 0.004]	0.003 [0.001; 0.005]	0.002 [0.001; 0.003]

Примечание. Данные представлены в виде средних значений и 95% доверительных интервалов. P 3-1 - различия между показателями групп «Нормотипичное развитие» и «Тяжелое течение РАС». P 3-2 - различия между показателями групп «Легкое течение РАС» и «Тяжелое течение РАС». Статистически значимыми считались различия при Р ≤ 0.05.

Ранее нами было показано [Филиппова, Алексеева, Бурмистрова, 2023], что дети с РАС имеют различия в уровнях цитокинов в плазме крови в зависимости от тяжести состояния. Дети с легким течением РАС демонстрируют высокие уровни IL-4, что может носить компенсаторный характер. У детей с тяжелым течением РАС в плазме крови установлены значимо высокие уровни основного цитокина Tx1 – IFN γ , и IL-6, на фоне низких уровней важного противовоспалительного цитокина – IL-10 и провоспали-тельных «цитокинов тревоги»: TNF α и IL-1 β [Филиппова, Алексеева, Бурмистрова, 2023]. Как показано G. Oxenkrug, сдвиг гомеостатического баланса про- / противовоспалительных цитокинов Tx1/Tx2 в сторону Tx1 (прежде всего, повышения уровней IFN γ ), на фоне продолжительного действия стрессовых факторов различной природы, приводит к развитию системного хронического воспаления низкой степени тяжести [Oxenkrug, 2011]. На основании полученных результатов, для выявления ассоциации уровней экспрессии микроРНК в лейкоцитах периферической крови с наличием/отсутствием системного хронического воспаления и тяжестью РАС, нами был проведен корреляционный анализ. Результаты анализа представлены на рисунке.

В группе детей с нормотипичным развитием все корреляции между уровнями экспрессии микроРНК и цитокинами плазмы имели слабую силу, статистически значимых взаимодействий не обнаружено (рисунок, A).

При оценке межсистемных связей в группе детей с легким течением РАС установлены две значимые положительные корреляции между: микроРНК-9 и IFN γ (ρ = 0.28, Р = 0.048); микроРНК-124 и TNF α (ρ = 0.29, Р = 0.044); и одно отрицательное взаимодействие между микроРНК-155 и TNF α (ρ = -0.31, Р = 0.035) (рисунок, Б).

В группе детей с тяжелым течением аутизма выявлены четыре значимые корреляции средней силы, которые были отрицательными: между микроРНК-9 и IFNγ (ρ = -0.43, Р = 0.016); микроРНК-146а и IFNγ (ρ = -0.37, Р = 0.042); микроРНК-146а и IL-6 (ρ = -0.36, Р = 0.048); микроРНК-155 и IL-10 (ρ = -0.46,

Р = 0.011) (рисунок, В).

	q	胃				斤
miR-9	-0.08	0.28	0.06	0.04	0.20	0.08
miR-21	-0.26	0.12	0.26	0.21	-OJO	0.12
miR-124	-0.22	0.13	0.23	0.29	-0.01	0.13
miR-146a	-0.06	-0.06	0.07	0.02	0.09	-0.20
miR-155	0.05	-0.17	-0.18	-0.31	-0.23	-0.15

Б. Легкое течение РАС

	£					-*
miR-9	0.24	0.20	-0.18	•0.22	0.15	0Л4
miR-21	0.01	0.09	-0.18	-0.22	0.08	-0.16
miR-124	0.01	0.16	-0.10	-0.12	0.02	-0.15
miR-146a	-0.20	0.08	-0.04	0.08	•0,11	-0.23
miR-155	0.25	-0.05	-0.05	-0.09	-0.12	-0.08

А. Нормотипичное развитие

Структура корреляционных связей между уровнем экспрессии микроРНК в лейкоцитах и концентрацией цитокинов в плазме крови детей с легким/тяжелым течением РАС и нормотипичным развитием.

Цифрами показана сила связи ( ρ ), а также её направленность – отрицательная и положительная. Статистически значимые корреляционные взаимодействия ( Р ≤ 0.05) показаны серым цветом

[The correlations structure between microRNA expression levels in leukocytes and cytokine levels in blood plasma of children with a mild/severe ASD and normotypical development.

Note: The numbers in the figures show the strength of the association ( ρ ), as well as its direction – negative and positive. Statistically significant correlations (p ≤ 0.05) are shown in gray]

Таким образом, у детей с тяжелым течением аутизма микроРНК146а демонстрирует низкие уровни экспрессии в лейкоцитах периферической крови и высокую корреляционную активность с цитокинами плазмы, а именно наличие значимых отрицательных связей с IL-6 и IFN γ .

Для оценки диагностической значимости экспрессии микроРНК-146а в лейкоцитах периферической крови в качестве маркера тяжести течения РАС у детей был проведен ROC-анализ. Показано, что уровень экспрессии микроРНК-146а в лейкоцитах меньше 0.0035 у.е. (чувствительность: 86.7%, специфичность 89.6%, площадь под ROC-кривой: 0.836±0.0362, 95%ДИ: 0.760–0.896) может свидетельствовать о тяжелом течении аутизма у детей.

Результаты исследований последних лет свидетельствуют, что иммунная дисрегуляция, в частности дисбаланс про-/противовоспалительного фенотипов иммунных клеток, и хроническое нейровоспаление выступают значимыми характеристиками РАС [Moaaz et al., 2019]. Недавно продемонстрировано, что интенсивность воспаления на клеточном уровне, как в ЦНС, так и в клетках врожденной и адаптивной иммунной системы, регулируют микроРНК, прежде всего, микроРНК-9, микроРНК-21, микроРНК-124, микроРНК-146a и микроРНК-155. Авторы подчеркивают, что эти микроРНК имеют перекрестные мишени в нервной и иммунной системах и обеспечивают механизмы коммуникации этих систем в норме и при патологии [Slota, Booth, 2019; Li, Lei, Sun, 2023].

В нашей работе проведена оценка различий в уровнях экспрессии пяти микроРНК: микроРНК-146а, микроРНК-124, микроРНК-21, микроРНК-9 и микроРНК-155, в лейкоцитах периферической крови детей с РАС в зависимости от тяжести состояния и степени выраженности системного воспаления, а также изучен вопрос о возможности использования показателей микроРНК в качестве биологических маркеров для диагностики РАС. Лейкоциты рассматривались нами как итог комплексного взаимодействия микроРНК–мРНК в общей совокупности клеток иммунной системы периферической крови, в определенной точке времени в условиях гомеостаза – нормотипичного развития, и системного хронического воспаления низкой степени тяжести – тяжелое течение РАС (наличие его показано нами ранее [Филиппова и др., 2022]).

В результате работы в группе детей с легким течением РАС, на фоне отсутствия различий в уровнях экспрессии микроРНК с показателями детей с нормотипичным развитием, нами выявлено наличие трех значимых корреляций слабой силы между системами микроРНК лейкоцитов и цитокинов плазмы крови. Положительное взаимодействие микроРНК-9/IFN γ может отражать обнаруженный T. Amado с соавторами эффект усиления экспрессии микроРНК-9 в Tx1 после активации инфекционными и стрессовыми стимулами, который приводит к увеличению выработки IFNγ этими клетками [Amado et al., 2015]. Отрицательная корреляция между уровнями экспрессии микроРНК-155 в лейкоцитах и концентрацией про-воспалительного цитокина – TNF α в плазме крови может быть связана с ключевой ролью микроРНК-155 в негативной регуляции сигнальных путей воспалительных иммунных ответов [Saba, Sorensen, Booth, 2014]. Объяснение положительной связи между микроРНК-124 и TNF α носит дискуссионный характер, т.к. в норме микроРНК-124 является важнейшим модулятором воспаления и врожденного иммунитета, который поддерживает противовоспалительный М2 фенотип тканевых резидентных макрофагов и переключение баланса Тх1/Tx2 в сторону Тх2 [Qin et al., 2016; Moaaz et al., 2019]. У лиц с РАС изменение экспрессии микроРНК-124 рассматривается авторами в контексте регуляции функций клеток ЦНС, т.к. она экспрессируется во всех нервных клетках всех регионов мозга, за исключением гипофиза, и регулирует синаптическую пластичность и сигнальные молекулы памяти [Han et al., 2020]. Литературные данные о роли микроРНК-124 в иммунной дисфункции при РАС нами не обнаружены. Мы предполагаем, что у детей с легкой степенью тяжести РАС, показанные нами ранее высокие концентрации ИЛ-4 в плазме крови [Филиппова и др., 2022], поддерживают экспрессию микроРНК-9, микроРНК-124, и микроРНК-155 в лейкоцитах на уровне детей с нормотипичным развитием, что приводит к отсутствию в плазме детей с легким течением РАС воспалительного профиля.

В группе детей с тяжелым течением РАС наиболее важные данные, как мы считаем, были получены для микроРНК-146а. Так, в лейкоцитах детей с тяжелым течением РАС уровни экспрессии микроРНК-146а были значимо снижены, по отношению к показателям детей с нормотипичным развитием и лиц с легким течением РАС. Кроме того, микроРНК-146 была задействована в отрицательных корреляциях с основными провоспалительными цитокинами – IFN γ и IL-6, уровни которых в плазме крови были повышены, что отражало состояние системного хронического воспаления низкой степени тяжести у детей с тяжелым течением РАС. Авторами показано [Taganov et al., 2006; Saba et al., 2014], что микроРНК-146а негативно регулирует воспалительные процессы в нейронах, микроглии, астроцитах, таким образом ограничивая воспаление внутри ЦНС, в результате активации транскрипционного фактора NF-kB. Во врожденном иммунном ответе микроРНК-146а модулирует поляризацию макрофагов в направлении М2 фенотипа через Notch1 путь [Taganov et al., 2006; Saba, Sorensen, Booth, 2014]. Особый интерес представляет отрицательная взаимосвязь микроРНК-146а/IL-6. Во-первых, транскрипция микроРНК-146а и IL-6 проходит под контролем NF- κ B, даже если обе молекулы играют антагонистическую роль в воспалительном процессе. Высказаны предположения, что при физиологических условиях ось микроРНК-146/IL-6 поддерживает функциональный баланс, но в присутствии соответствующих провоспалительных стимулов уровни IL-6 «драматически» увеличиваются, а уровни микроРНК-146а – снижаются [Olivieri et al., 2021]. Более того, нами показано, что уровень экспрессии микроРНК-146а в лейкоцитах меньше 0,0035 у.е. с чувствительностью 86.7% и специфичностью 89.6%, позволяет выделить из общей когорты детей с РАС группу детей с тяжелым течением заболевания.

Заключение

Таким образом, у детей с тяжелым течением РАС нами выявлены нарушения в системе регуляции воспаления (на уровне экспрессии микроРНК): значимое снижение уровней экспрессии важных негативных регуляторов воспаления и участников нейро-иммунных взаимодействий – микроРНК-146а и микроРНК-124. Корреляционные связи между экспрессией микроРНК в лейкоцитах и концентрациями про/провоспалительных цитокинов в плазме крови (прежде всего, отрицательные взаимодействия: мик-роРНК-146а/IL-6 и микроРНК-146а/IFN γ ), вероятно, могут отражать возможные пути, посредством которых системное хроническое воспаление низкой степени тяжести может регулировать цитокиновый потенциал лейкоцитов у детей с тяжелым течением РАС. Наконец, нами продемонстрирована связь между низкими уровнями экспрессии микроРНК-146а в лейкоцитах и тяжестью РАС. При расширении исследований уровни экспрессии микроРНК-146а в лейкоцитах периферической крови могут быть предложены как дополнительные маркеры для диагностики тяжелого течения аутизма у детей. Тем не менее, конкретные механизмы участия изученных нами микроРНК в иммунной дисфункции при РАС требуют более детального изучения, т.к., согласно данным литературы, одна микроРНК может связывать сотни различных мРНК, а единственная мРНК может выступать мишенью многих микроРНК. В результате мик-роРНК–мРНК формируют комплексные генные сети, которые регулируют различные биологические функции [Plotnikova, Baranova, Skoblov, 2019].