Профилирование микроРНК плазмы крови в качестве маркеров ранней диагностики меланомы кожи

Цель: Несмотря на достижения последних десятилетий, такие аспекты заболевания меланомой кожи, как выявление предрасположенности, сверхранняя диагностика, поиск специфических маркеров и разработка комплексной программы в рамках персонализированного сопровождения пациента, остаются крайне актуальными. В связи с этим целью нашего исследования является анализ профиля микроРНК плазмы крови для выявления маркеров ранней диагностики меланомы кожи. Настоящая работа представляет собой промежуточные результаты исследований по российско-израильскому проекту, с российской стороны поддержанному Фондом инфраструктурных и образовательных программ группы РОСНАНО.

Материалы и методы: Материалом для изучения послужили образцы венозной крови: первая группа — доноры, имеющие повышенный риск развития меланомы, 71% женщин и 29% мужчин, возраст от 33 до 67 лет; вторая группа — пациенты с установленным диагнозом меланома кожи, 57% женщин и 43% мужчины, возраст от 37до 71 года, пролеченные в НМИЦ онкологии им. Н. Н. Петрова (г. Санкт-Петербург) и ГУЗ Областной клинический онкологический диспансер (г. Ульяновск) с 2017 по 2018 г. Забор крови осуществляли в вакуумные пробирки с ЭДТА, после чего проводили центрифугирование при 4°C в течение 10 минут при 1900×g, далее отбирали плазму в объеме 200 мкл. К изучаемым образцам плазмы в качестве экзогенного контроля добавляли синтетическую 0,05 мкМ микроРНК cel-miR-39-3p в количестве 2 мкл на 200 мкл плазмы. Для выделения miRNA из плазмы крови использовали набор mirVana miRNA Isolation Kit (Ambion/Thermo Scientific) по стандартному протоколу. Синтез кДНК и амплификацию проводили с использованием коммерческого набора TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific) по стандартной методике. Для количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР-РВ) использовали TaqMan Fast Advanced Master Mix и TaqMan Advanced miRNA Assay (Thermo Scientific). Изучали профиль следующих микроРНК: hsa-miR-21-5p, hsa-miR-149-3p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-155-5p и hsa-miR-193a-3p. Данный перечень микроРНК обусловлен результатами предыдущих исследований (Швецова и др., 2014; Fogli et al., 2017; Howell et al., 2010; Mirzaeia et al., 2016; Segura et al., 2012). ПЦР проводили с использованием амплификатора qTower 2.2 (Analytik Jena). Для анализа результатов ПЦР-РВ использовали программное обеспечение qPCRsoft 3.0 (Analytik Jena). Значение порогового цикла (Ct) определяли при показаниях пороговой линии 0,1. Каждую реакцию проводили в трех повторностях, на основании чего находили среднее значение Ct. С целью определения содержания микроРНК в образцах рассчитывали значение относительной концентрации (RQ) относительно экзогенного контроля по формуле: RQ = 2^(Ct экзогенный контроль - Ct целевая микроРНК ) . При расчете среднего значения RQ (RQ_ср) учитывали только результаты с положительной детекцией.

Результаты: Из всех изучаемых микроРНК у первой группы выявлена hsa-miR-21-5p — у 85% обследуемых. У 71% пациентов второй группы выявлены hsa-miR-21-5p, hsa-miR-150-5p и hsa-miR-155-5p. Остальные изучаемые ми-

Меланома и опухоли кожи кроРНК в образцах плазмы не выявлены, что может быть связано как с их отсутствием, так и недостаточной чувствительностью тест-систем.

Заключение: В настоящем исследовании показана перспективность использования в качестве молекулярно-генетических маркеров меланомы кожи микроРНК hsa-miR-150-5p и hsa-miR-155-5p плазмы, которые были обнаружены у 71 % обследуемых с диагнозом меланома и вовсе не были детектированы у пациентов первой группы. Очевидно, что диагностика меланомы кожи в связи с различной этиологией заболевания может быть осуществлена на основе нескольких молекулярно-генетических маркеров при условии их детекции одновременно.Ми-кроРНК hsa-miR-21-5p выявлена в обеих группах обследуемых, при этом отмечается высокая вариабельность в её концентрации, из чего следует, что данный тип микроРНК не может рассматриваться в качестве специфического для диагностики меланомы. Исследования (Fogli et al., 2017) показали, что комбинация микроРНК плазмы крови hsa-miR-149-3p, hsa-miR-150-5p и hsa-miR-193a-3p может обладать диагностическим потенциалом в аспекте диагностики меланомы. Однако, в нашем исследовании hsa-miR-149-3p и hsa-miR-193a-3p вовсе не были выявлены в плазме крови у обеих групп. Следует отметить необходимость продолжения исследований в области изучения микроРНК плазмы в аспекте их использования в качестве молекулярно-генетических маркеров меланомы с включением в анализ большего количества изучаемых микроРНК и большего числа пациентов, а также с привлечением большего числа данных — биометрических данных пациентов, стадии и типа меланомы кожи, другие сопутствующие заболевания обследуемых. Также перспективным с позиции ранней диагностики меланомы кожи является анализ профиля микроРНК экзосом.