Прогностическая роль молекулярных подтипов рака толстой кишки. Современный взгляд на проблему

Актуальность

Рак толстой кишки (РТК) является одним из лидеров по заболеваемости и смертности среди злокачественных опухолей в России и в мире, занимая 4-е место в структуре общей заболеваемости и 3-е место в структуре смертности от рака среди российского населения. В 2018 г. на долю РТК приходилось около 45 тыс. новых случаев и более 23 тыс. смертей [1, 2]. Несмотря на то, что общая выживаемость пациентов с РТК за последние 30 лет выросла, 5-летняя выживаемость для пациентов c региональным распространением достигла только 70 %, а с отдаленными метастазами – 14 % [3, 4]. Следует отметить, что среди пациентов, которые подвергаются хирургическому вмешательству по поводу РТК II–III стадий, примерно у одной трети развивается прогрессирование заболевания с отдаленным метастатическим поражением печени и легких – в 20 % и 16 % соответственно, а среднее время до прогрессирования равняется 14 мес [5]. Такие различные прогностические перспективы у относительно однородной группы пациентов связывают с молекулярно-генетическими различиями в опухолевой трансформации и гетерогенностью карцином толстой кишки [6], что подчеркивает необходимость разработки прогностических и предсказательных биомаркеров, которые можно использовать в рутинной клинической практике для повышения эффективности лечения и снижения смертности, связанной с этим заболеванием.

Основные пути канцерогенеза рака толстой кишки и их клинические особенности Рак толстой кишки на данный момент стратифицируется на основе клинических и гистопатологических параметров, таких как размер опухоли, ее распространённость и степень дифференцировки. Данные параметры обусловливают выбор вида адъювантного лечения. Приведенные выше данные о количестве случаев прогрессирования на фоне такого эмпирического лечения обусловливают актуальность поиска дополнительных биологических маркеров, ассоциированных с эффективностью проводимой терапии. Кроме того, клинические параметры ограничивают понимание биологии опухоли и во многих случаях неадекватны для принятия решения о выборе адъювантной схемы лечения у пациентов с РТК. Важным в поиске прогностических критериев является изучение процессов канцерогенеза эпителия кишечника, среди которых выделяют: 1) микросателлитную нестабильность (MSI), 2) хромосомную нестабильность (CIN) и 3) метилирование островков CpG (CpG Island Methylator Phenotype, CIMP) [7].

Большинство пациентов с РТК имеют CIN (65–85 %) и характеризуются наличием «классического», или «канонического», типа рака [8]. Наличие хромосомных аномалий в аденомах позволяет предположить, что CIN возникает на ранней стадии развития рака [9]. Хотя молекулярные механизмы, ответственные за развитие CIN, остаются неясными, большие хромосомные аберрации, включая дупликацию и анеуплоидию, мутации в гене TP53 и других генах контрольных точек, способствуют образованию рака с хромосомной нестабильностью. Кроме этого, в ряде работ было показано, что онкогенный стресс, обусловленный нестабильностью генома, разрушением теломер и гипометилированием ДНК, может играть роль в индукции CIN в РТК [10]. В отличие от пациентов с MSI, больные с CIN имеют относительно неблагоприятный прогноз, особенно на ранних стадиях заболевания [11].

MSI представляет гипермутированный тип опухоли, возникший в связи с потерей активности системы репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (mismatch repair, MMR), и составляет около 12–15 % всех случаев рака толстой кишки. Из них 2–3 % MSI-позитивных РТК связаны с синдромом Линча, а остальные представляют спорадическую или приобретенную форму заболевания. Основным отличием является то, что большинство спорадических опухолей с MSI развиваются посредством гиперметилирования гена промотора MLH1, в то время как опухоли с синдромом Линча приобретают MSI посредством врожденной мутации в одном из генов MMR, которые включают MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2 [7]. Недавние исследования показали, что спорадические случаи РТК с MSI часто связаны с зубчатой неоплазией и имеют мутации BRAF-V600E, в то время как пациенты с синдромом Линча не имеют мутаций BRAF [12]. Наличие MSI в РТК, как правило, исключает CIN опухолевых клеток. MSI опухоли обычно демонстрируют почти диплоидный кариотип и несут набор уникальных мутаций генов, которые отличаются от наблюдаемых в СIN [13]. MSI ассоциируется с лучшим прогнозом и снижением метастазирования [14]. Высокий уровень микросателлитной нестабильности (MSI-H) или дефектный MMR (dMMR) являются предикторами низкого ответа на терапию препаратами фторурацила [15], но определяют вероятность положительного эффекта от иммунотерапии [16].

Эпигенетическая нестабильность, вызванная гиперметилированием промотора CpG-островка, является другим хорошо известным путем канце- рогенеза РТК. Аберрантное метилирование ДНК присутствует практически во всех опухолях толстой кишки, однако у 10–20 % пациентов наблюдается чрезвычайно высокая частота аберрантно метилированных локусов CpG [17]. В соответствии с уровнем CIMP [18] опухоли толстой кишки можно разделить на группы с высоким CIMP и низким CIMP, связанные с различными предшествующими воздействиями [17–20]. Фенотип с высоким уровнем CIMP более часто демонстрирует худший прогноз. Опухоли с CIMP-H склонны ассоциировать с MSI и мутациями BRAF, но не имеют мутаций KRAS и TP53 [21]. Пациенты с высоким уровнем CIMP и MSI имеют более благоприятный прогноз выживаемости [22]. Тем не менее отношения между CIMP, MSI и BRAF остаются до конца неясными. Рассмотренные молекулярные пути развития рака дают нам представление о канцерогенезе РТК, но они не полностью отражают сложность и неоднородность ландшафта опухоли.

Молекулярно-генетическая гетерогенность рака толстой кишки

В последние десятилетия несколько инициатив и консорциумов по борьбе с раком создали крупномасштабные многокомпонентные базы данных, позволяющие исследовать различные типы рака путем стратификации их характеристик. В этом контексте прежняя «мутационноориентированная» классификация, основанная на единичных мутациях, в настоящее время постепенно смещается в сторону более «транскриптомного» молекулярного типирования. Некоторые из систем классификаций на основе транскрип-тома продемонстрировали превосходную связь с клиническими исходами, что делает их более привлекательными для последующего перевода в клиническую практику. Для РТК недавно было сообщено о 6 независимых системах классификации [23–28]. Из-за различий в выявленных когортах пациентов, экспрессии генов профилирующих платформ, биоинформационного анализа и интерпретации данных каждая система определила различное число подтипов рака толстой кишки, которые кажутся разнородными. Для выявления потенциальных совпадений и создания более унифицированной таксономии в 2014 г. был создан Консорциум субтипирования колоректального рака (CRC Subtyping Consortium), который включал шесть независимых исследовательских групп и Sage Bionetworks в качестве дополнительной группы оценки. Используя сетевой метаанализ шести систем типирования, были идентифицированы четыре уникальных консенсусных молекулярных подтипа (CMS), после чего была проведена их комплексная мультиомная и клиническая характеристика. Было продемонстрировано прогностическое значение данной классификации независимо от стадии процесса [29].

После сетевого метаанализа, основанного на комплексных мультиомных характеристиках, CRC Subtyping Consortium обнаружил, что четыре CMS действительно связаны с различными молекулярными свойствами и клиническими характеристиками. Первый подтип (CMS1) – «иммунный». Встречается примерно в 14 % случаев РТК. Характеризуется гипермутированным фенотипом, высокой микросателлитной нестабильностью, высокой CIMP, диффузной иммунной инфильтрацией, мутацией BRAF V600E. CMS1 ассоциирован с ухудшением выживаемости после рецидива. Второй подтип (CMS2) – «канонический». Встречается с частотой примерно 37 %. CMS2 активируется путем Wnt-β-катенина и связан с самой высокой общей выживаемостью. Третий подтип (CMS3) – «метаболический». Частота встречаемости около 13%. CMS3 эпителиальный подтип с выраженной метаболической дисрегуляцией. Четвертый подтип (CMS4) – «мезенхимальный». Обнаруживается примерно в 23 % случаях РТК. CMS4 характеризуется повышенной регуляцией EMT, активацией TGF-β, ангиогенезом, стромальной инфильтрацией. Карциномы мезенхимального подтипа связаны с неблагоприятным прогнозом, высоким риском отдаленных метастазов и перитонеального канце-роматоза, а также резистентностью к стандартной химиотерапии, худшей безрецидивной и общей выживаемостью [29–32]. Помимо 4 основных подтипов 13 % образцов пациентов с РТК не были отнесены к определенному подтипу CMS, что указывает на смешанный фенотип или внутрио-пухолевую гетерогенность.

Различное течение рака толстой кишки в зависимости от расположения первичной опухоли нашло отражение в классификации молекулярных подтипов, что подчеркивает их биологическое различие [33]. Так, опухоли, поражающие правую половину толстой кишки, чаще принадлежат к CMS1 и CMS3, диагностируются у пожилых лиц, гистологически характеризуются муцинозным раком и имеют худший прогноз по сравнению с новообразованиями левосторонней локализации. CMS2 и CMS4 локализуются преимущественно в левой части ободочной кишки, диагностируются у молодых пациентов и имеют относительно благоприятный прогноз [34].

Возможности реализации молекулярной классификации в реальной клинической практике

Выбор оптимальных критериев зависит от доступности методов, их пропускной способности, стоимости и качества анализа. С одной стороны, платформы с высокой пропускной способностью, такие как RNA-Seq и микрочипы для анализа экспрессии генов, предоставляют информационное содержание всего генома, идеально подходят для исследовательских целей, но не подходят для клинических применений из-за высокой стоимости, плохой доступности и длительного выполнения. Несмотря на огромный энтузиазм, проявленный научным сообществом в этой работе, и достигнутые успехи, перевод системы CMS в клиническую практику оказался невозможным из-за перечисленных ограничений с исследованием мутаций генов. Текущий классификатор CMS использует алгоритм с участием сотен генов [29], что обусловливает неосуществимую задачу для разделения РТК в условиях реальной клинической практики. С другой стороны, традиционные методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), иммуногистохимическое исследование (ИГХ) и имму-ноферментный анализ (ИФА), легко доступны, но не подходят для профилирования сотен генов, которые в настоящее время требуются для классификации CMS. В этом контексте представляется актуальной разработка других критериев стратификации пациентов с РТК.

Определение гипериммуногенных опухолей

CMS1 характеризуется гипермутированным фенотипом – микросателлитной нестабильностью. В ходе репликации ДНК часто происходят нарушения и возникают короткие последовательности неспаренных оснований или микросателлитов. Процесс восстановления несоответствий ДНК осуществляется системой репарации – MMR, за работу которой ответственны 6 генов: MSH2, MLH1, PMS2, MSH3, MSH6 и MLH3. Врожденные мутации в этих генах приводят к развитию синдрома Линча [35]. Микро-сателлитная нестабильность чаще является следствием дефицита MMR (dMMR), в подавляющем большинстве случаев заключающегося в метилировании промотера MLH1 в опухоли. В результате дефицита MMR возникает большое число мутаций со сдвигом рамки считывания, что приводит к формированию стоп-кодонов и синтезу нефункциональных белков [36]. Пациенты со спорадическими MSI опухолями имеют хороший прогноз [37].

ПЦР используется в качестве классического метода определения MSI, которая амплифицирует микросателлитные повторы в ДНК, и путем сравнения их длины между опухолевыми и нормальными клетками определяется уровень нестабильности генома. В настоящее время применяется панель из 5 маркеров на мононуклеотидные (BAT26, BAT25) и двунуклеотидные последовательности (D2S123, D5S346, D17S250) [38]. Посредством сравнения выделяют 2 варианта MSI: MSI-Н (высокий уровень MSI), когда ≥2 маркеров нестабильны, MSS (стабильный уровень), когда стабильны все маркеры. Значение низкого уровня MSI-L (низкий уровень MSI), когда нестабилен 1 маркер, до сих пор четко не установлено, и этих пациентов расценивают как больных с MSS опухолями [39].

Вторым методом диагностики dMMR является иммуногистохимическое исследование, когда в опухоли изучается экспрессия белков MSH2, MLH1,

PMS2, MSH6. В случае отсутствия окрашивания хотя бы одного белка устанавливается дефицит MMR [40].

Описанные методики демонстрируют высокую чувствительность (95 %) и считаются эффективными, однако являются взаимодополняющими, так как существуют редкие варианты нарушения MMR, диагностируемые только ПЦР или только ИГХ. Оба метода создают потенциальные проблемы для интерпретации, что приводит как к ложноположительным, так и к ложноотрицательным результатам [41]. Таким образом, гистоморфологические признаки, которые соответствуют характеристикам опухоли с dMMR, следует рассматривать как ценные дополнения к ПЦР и ИГХ-тестированию, поскольку они способны предоставить важную информацию [42]. Избыточный ответ иммунной системы на опухолевые антигены, представляющий собой инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TILs), перитуморальные лимфоциты, может быть наиболее значимым гистологическим признаком dMMR [43]. Эти гистологические данные отражают повышенную иммуногенность опухоли, являются следствием изменений ДНК (вставок, де-лециий и мутаций со сдвигом рамки считывания), которые характеризуют опухоли с dMMR [44]. Увеличение антигенности, а в результате избыточный иммунный ответ может объяснить благоприятный прогноз для пациентов с РТК MSI-H по сравнению с пациентами с опухолями MSS [45–47].

Гистологическая картина иммуногенного фенотипа, который обычно наблюдается в опухолях dMMR, может служить потенциальным маркером CMS1. Характерный гистологический вид РТК с dMMR включает в себя медуллярные и/или муцинозные признаки, инфильтрацию опухоли лимфоцитами и высокую дифференцировку клеток [48].

Однако в исследовании A. Bittoni et al. было обнаружено, что может существовать несоответствие между статусом MMR опухоли и гистологической картиной. Статус dMMR не является единственным механизмом, который приводит к иммуногенному фенотипу [49]. Существует ряд других причин нарушения регуляции, которые могут приводить к богатому антигенному фенотипу, вызывая высокую мутационную нагрузку опухоли [50–52]. Дефицит в других системах репарации ДНК (DDR) – такой как дефицит гомологичной рекомбинации, дефицит корректирующей ДНК-полимеразы-ε или ДНК-полимеразы-δ1 (POLE или POLD1), или повреждения основной системы эксцизионной репарации – может привести к высоким значениям мутационной нагрузки и антиген-обогащенному фенотипу, гистологически сходному с dMMR опухолями [52].

Таким образом, при создании суррогатной классификации CMS следует учитывать морфологические проявления опухоли и включать гистологическую оценку иммуногенности.

Определение мезенхимальных опухолей

Эпителиально-мезенхимальный переход (EMT) – обратимый клеточный процесс, характеризующийся изменениями в экспрессии генов и активацией белков, способствующий трансдифференцировке эпителиального фенотипа в мезенхимальный. Этот процесс увеличивает миграцию и инвазию опухолевых клеток, устойчивость к апоптозу и химиотерапии, что приводит к прогрессированию опухоли. Одним из сигнальных путей, участвующих в EMT, является путь митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) и подсемейство белков ERK [53].

Многие исследования были направлены на поиск маркеров мезенхимоподобного молекулярного подтипа РТК. Так, в работе Anne Trinh et al. были проанализированы следующие белки: HTR2B, ZEB1, CDX2, FRMD6 и KER. Предложенный классификатор продемонстрировал 87 % соответствие с оригинальным консорциумом, основанным на транскриптомном анализе [54].

HTR2B – рецептор серотонина с высокой экспрессией в мезенхимальных опухолях [55]. Серотонин (5HT) посредством стимуляции HTR1B и HTR2B активирует сигнальный путь ERK, что способствует экспрессии, активации и субклеточному перемещению различных белков, которые регулируют EMT, тем самым способствуя прогрессированию опухоли [56].

ZEB1 (Zinc finger E-box binding homeobox 1, также известный как TCF8 и δEF1), является одним из ключевых факторов, ингибирующих E-кадгерин и индуцирующих эпителиально-мезенхимальный переход [57]. В дополнение к репрессии генов эпителиальной полярности и адгезии ZEB1 активирует мезенхимальные маркеры стволовости [58]. Следовательно, экспрессия ZEB1 способствует канцерогенезу, метастазированию и коррелирует с худшим прогнозом при колоректальном раке [59–60]. Выступая в роли репрессора E-кадгерина, ZEB1 не экспрессируется в нормальном эпителии, а также в центре опухолевого узла высокодифференцированных карцином [61]. ZEB1 наиболее активен на инвазивном фронте опухолей в недифференцированных раковых клетках, которые транс-лоцировали b-катенин в ядро и, следовательно, демонстрируют активную передачу сигналов Wnt [62]. ZEB1 играет важную роль в резистентности клеток рака толстой кишки к химиотерапии [63].

FRMD6 (FERM domain containing 6, EX1, Willin) является важным адаптерным белком сигнального пути Hippo, связывающим ассоциированные с плазматической мембраной белки с цитоскелетом [64], и имеет высокую экспрессию в мезенхимоподобных опухолях [23].

CDX2 – транскрипционный фактор эпителиальных клеток кишечника. Сниженная экспрессия CDX2 коррелирует с низкой степенью дифференцировки, правосторонней локализацией опухоли, MSI, мутацией BRAF [65] и неэпителиальными подтипами CMS1/4 [54]. Анализ выживаемости больных с колоректальным раком II–IV стадий показал, что отсутствие экспрессии CDX2 является независимым отрицательным прогностическим маркером [66]. Однако отсутствие экспрессии CDX2 слабо коррелирует с распространенностью опухоли, а при анализе каждой стадии отдельно статистически значимая связь с худшей 5-летней общей выживаемостью была обнаружена только у пациентов с IV стадией [67]. Фармакогеномный анализ доклинических моделей РТК показывает, что CDX2-негативные клетки более чувствительны к стандартным химиотерапевтическим средствам и демонстрируют значительное подавление генов, обеспечивающих множественную лекарственную устойчивость [67].

Определение эпителиальных подтипов

CMS2 характеризуется эпителиальными особенностями, CIN, активированными сигнальными путями Wnt и MYC. Опухоли CMS2 чаще локализуются в дистальной части толстой кишки (59 %) и имеют более высокую выживаемость после рецидива (35 мес), эти характеристики контрастируют с опухолями CMS1, которые чаще встречаются в проксимальной части толстой кишки и демонстрируют меньшую выживаемость после рецидива (9 мес) [29]. CMS3 характеризуется нарушением регуляции метаболических процессов, мутациями KRAS, CIN, низким уровнем CIMP, смешанным статусом MSI. По уровню экспрессии генов CMS3 оказался наиболее похожим на нормальную ткань толстой кишки. F.D.E. De Palma et al. предположили, что предраковое изменение KRAS мутантного рака толстой кишки, т.е. большинство видов рака CMS3, представляет собой зубчатую тубуловил-лезную аденому, смешанный гистологический вариант между CMS1 и CMS2. Анализ сигнальных путей CMS3 подтипа показал вовлеченность мРНК в 9 метаболических путей из 10, включая метаболизм глутамина, жирных кислот и лизофос-фолипидов [68]. Средняя 5-летняя выживаемость для всех стадий у CMS2 и CMS3 является более высокой, составляя 77 % и 75 % соответственно, по сравнению с CMS1 – 73 % и CMS4 – 62 %. В связи со схожим прогнозом и течением CMS2 и CMS3 возможно их изучение в объединенном «эпителиальном» подтипе.

Заключение

Существует актуальная проблема относительно стратегии адъювантного лечения рака толстой кишки, которая способствовала бы снижению смертности. В течение последних десятилетий в центре внимания определение молекулярной принадлежности рака толстой кишки для выбора более персонализированной и оптимальной стратегии лечения, однако недоступность средств тестирования на настоящий момент создает неосуществимую задачу для определения подтипов рака толстой кишки в условиях реальной клинической практики. В этом контексте представляется актуальным исследование новых критериев стратификации пациентов с раком толстой кишки. Перспективной