Прогностическая значимость содержания некоторых факторов роста и их рецепторов в сыворотке крови у больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой

Введение. Диффузная В-крупноклеточная лимфома (ДВКЛ) - составляет до 50 % всех случаев неходжкинской лимфомы и представляет собой гетерогенную группу заболеваний, имеющих общие звенья патогенеза, но при этом различные клинические и иммуногистохимические особенности, чувствительность к терапии и прогноз.

Несмотря на успех применения стандартных схем химиотерапии CHOP и R-CHOP, а также растущее число прецизионных методов лечения, гетерогенность ДВКЛ остается проблемой, о чем свидетельствуют рефрактер- ность к терапии, а также рецидивы у 40 % больных [1].

Международный прогностический индекс IPI, разработанный более 20 лет назад, рассчитывается на основе клинических показателей (возраст, уровень лактатдегидрогеназы в крови, количество пораженных экст-ранодальных очагов, стадия и общий соматический статус пациента по шкале ECOG). Баллы IPI могут в определенной степени отражать ответ на лечение, рецидивы и выживаемость пациентов с ДВКЛ, но, поскольку они не учитывают факторы, характеризующие биологические и молекулярные особенности злокачественной опухоли, прогноз может быть ошибочным [2].

Солидные и гематологические новообразования, включая ДВКЛ, распространяются посредством использования механизмов, позволяющих питать опухоль. В результате ряда ауто- и паракринных стимулов ангиогенез и иммуносупрессия выступают как одновременные процессы [3].

В определенных ситуациях ангиогенез необходим для роста, распространения и инфильтрации злокачественных клеток в тканях [4]. Сначала опухоли могут размножаться и выживать, используя доступные сосуды своего окружения, но по мере роста злокачественные клетки удаляются от питательных веществ и кислорода, становятся гипоксическими и создают новые сосуды для удовлетворения своих метаболических потребностей [5]. Формирование сосудов для диффузной В-крупноклеточной лимфомы при росте, прогрессировании и метастазировании также очень важно [6]. Некоторые наблюдения показывают, что неоангио- и лимфангиогенез при лимфомах может коррелировать с агрессивным течением заболевания, а также участвовать в развитии лекарственной резистентности у больных ДВКЛ [7, 8].

Значимость микроокружения в поддержании роста солидных опухолей уже давно не вызывает вопросов, в то время как при гематологических злокачественных новообразованиях внимание сосредоточено на более автономных фенотипических и функциональных характеристиках [1] и зачастую упускается из виду тот факт, что микроокружение ДВКЛ также оказывает прямое или, возможно, опосредованное влияние на патологический процесс [9].

Трансформированные клетки сами по себе не способны образовывать опухоли с метастатическим потенциалом; этот процесс требует благоприятного микроокружения, которое может иметь решающее значение для прогрессирования опухоли. Взаимная связь между злокачественными клетками и неопухолевыми клетками микроокружения приво- дит к развитию высокой пролиферации и метастатической способности опухоли [10]. Известно, что клетки крови, в частности лимфоциты и тромбоциты, являются источниками многочисленных факторов роста и их рецепторов, включая эпидермальный фактор роста (EGF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), трансформирующий фактор роста α и β (TGFα и TGFβ), инсулиноподобные факторы (IGF-I и IGF-II), которые играют жизненно важную роль в пролиферации, инфильтрации и метастазировании опухоли [11, 12].

Таким образом, несмотря на то что иммуногистохимические исследования, цитогенетика и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) уже прочно вошли в диагностику гемопоэтических опухолей, гетерогенность ДВКЛ продолжает мешать окончательной реализации персонализированной терапии. Следовательно, поиск новых прогностических биомаркеров, которые обеспечат более точное определение прогноза ДВКЛ и помогут клиницисту вовремя выделить пациентов с плохим ответом на стандартную терапию, по-прежнему актуален.

Цель исследования. Изучить содержание в сыворотке крови больных ДВКЛ некоторых факторов роста и их рецепторов для выявления их прогностической значимости в течении заболевания.

Материалы и методы. Были обследованы 63 пациента с ДВКЛ, находившихся на лечении в отделении онкогематологии ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России с 2016 по 2020 г. Все больные подписали добровольное информированное согласие на использование результатов исследования в научных целях.

Среди обследованных было 32 мужчины и 31 женщина, средний возраст которых составил 55,6 года (23–88 лет). В каждом случае диагноз ДВКЛ устанавливался на основании результатов гистологического и иммуногистохимического анализа биопсийного материала первичной опухоли. Проводили исследование 5 параметров, включенных в IPI. Все пациенты получали стандартное лечение с применением схем R-CHOP.

В сыворотке крови больных до лечения и после 4 курсов (из 6–8 проводимых) полихимиотерапии методом ИФА определяли уровень факторов роста VEGF-A, VEGF-C, EGF, TGFβ1, IGF-I, IGF-II и их растворимых рецепторов sVEGFR3, sEGFR, sTGFβR2. Также уровень вышеперечисленных факторов роста и их рецепторов определяли в крови условно здоровых доноров (n=20) – мужчин и женщин такого же возраста без злокачественной патологии и хронических заболеваний в стадии обострения.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATIS-TICA 10.0. Данные представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего. Соответствие распределения нормальному оценивали с помощью критерия Шапиро – Уилка. Значимость различий между независимыми выборками оценивали с помощью критерия Манна – Уитни и t-критерия Стьюдента. Значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты. Анализ полученных данных показал, что больные обладали следующими характеристиками, значимыми для IPI: возраст старше 60 лет – у 24 (38 %) чел., уровень лактатдегидрогеназы выше нормальных значений – у 6 (10 %) чел., общесоматический статус по шкале ECOG ≥2 – у 56 (86 %) чел., III–IV стадии – у 31 (49 %) чел., поражение больше одного экстранодального органа – у 12 (19 %) чел. Согласно результатам анализа по IPI-показателям высокий и высокий промежуточный риск был определен только у 9 (14 %) чел., остальные 54 (86 %) чел. входили в категорию низкого и низкого промежуточного риска.

Пациенты находились под наблюдением в течение 4 лет и в зависимости от клинического исхода были разделены на 3 основные группы:

• 1-я группа – пациенты с установленной ремиссией заболевания длительностью в среднем 44 мес., n=36 (57 %);

• 2-я группа – пациенты с рефрактерной к химиотерапии формой заболевания, n=14 (22 %);

• 3-я группа – пациенты с выявленными рецидивами после проведенного ранее химиотерапевтического лечения, n=13 (21 %).

Таким образом, группа неблагоприятного исхода была больше, чем прогнозируемая по IPI: 43 % больных вместо 14 %, а ремиссия наступила только у 57 % пациентов вместо предполагаемых 86 %.

В результате лабораторных исследований установлено, что у больных ДВКЛ до лечения, по сравнению с показателями доноров, в крови было повышено содержание VEGF-A в 3,2 раза, VEGF-R3 в 4,1 раза, IGF-I в 4,3 раза, IGF-II в 2,6 раза, TGFβ1 в 2,1 раза, но снижен уровень растворимого рецептора sEGFR в 1,5 раза (табл. 1). Соотношения лигандов к растворимым рецепторам, демонстрирующие биодоступность исследуемого фактора роста, также отличались от показателей нормы: VEGF-С/sVEGFR3 было ниже в 4 раза, а EGF/sEGFR и TGFβ1/sTGFβR2, напротив, выше в 1,9 и 6,1 раза соответственно.

У больных с ранними рецидивами заболевания или рефрактерных к проводимой терапии уровень VEGF-A в сыворотке крови после проведенного лечения по-прежнему превышал показатели здоровых доноров в 2,4 и 3,9 раза соответственно. Только у пациентов с последующей ремиссией концентрация VEGF-A в крови после лечения не имела значимых отличий от нормы и была ниже по сравнению с больными до лечения в 3,5 раза, пациентами с ранними рецидивами – в 2,7 раза и рефрактерными больными – в 3,9 раза.

Содержание VEGF-C в крови больных из групп с рецидивами и рефрактерным течением заболевания не имело значимых отличий от показателей до лечения и показателей у доноров, тогда как у больных с ремиссией оказалось в 1,5 раза ниже.

Таблица 1

Table 1

Уровень факторов роста и их рецепторов в крови больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой в зависимости от исхода лечения

The level of growth factors and their receptors in the blood of patients with diffuse large B-cell lymphoma depending on the treatment outcome

	Норма Norm	Больные до лечения Patients before treatment	Больные с рецидивами Relapsed patients	Рефрактерные больные Refractory patients	Больные с ремиссией Remission patients
VEGF-A	219,6±4,4	693,1±5,891	520,4±4,601, 2, 3	845,2±12,41, 2	196,9±6,33
VEGF-C	0,21±0,01	0,22±0,009	0,18±0,0162	0,23±0,0142	0,14±0,0071, 3
VEGFR3	15,1±0,28	61,3±1,831	54,4±1,381, 2	67,14±2,71, 2	108,92±3,461, 3
VEGF- С/sVEGFR3×1000	13,9±1,0	3,59±0,311	3,3±0,031, 2	3,4±0,311, 2	1,28±0,111, 3
EGF	164,5±3,35	205,5±4,571	190,3±6,22	217,7±6,31	196,6±6,21
EGFR	64,7±1,72	44,9±1,951	46,6±0,931, 2	42,36±1,921, 2	69,1±2,463
EGF/sEGFR	2,5±0,19	4,58±0,441	4,1±0,391, 2	5,13±0,491, 2	2,85±0,26
IGF-I	106,2±3,29	459,8±5,601	434,9±3,861, 2	485,6±9,31, 2	292,3±5,41, 3
IGF-II	360,6±3,79	950,4±35,31	1089,3±27,141, 2	802,7±14,041, 2	526,6±7,971, 3
TGFβ1	203,7±8,3	435,7±19,71	481,3±20,51	379,9±3,451	397,2±14,151
TGFβR2	607,5±40,13	203,8±10,31, 2	171,3±7,631, 2	151,96±7,71, 2, 3	499,1±3,51, 3
TGFβ1/sTGFβR2	0,35±0,025	2,13±0,111, 2	3,0±0,171, 2	2,5±0,161, 2	0,8±0,021, 3

Примечание. Значимые различия по сравнению с: ¹ – показателями нормы (здоровые доноры); ² – показателями у больных с ремиссией; ³ – показателями до лечения (р˂0,05).

Note. The differences are significant compared with: ¹ – the norm (healthy donors); ² – remission patients; ³ – patients before treatment (p<0.05).

Уровень растворимого рецептора sVEGFR3 в сыворотке крови у пациентов с благоприятным исходом заболевания оказался значительно выше, чем у больных с рецидивами (в 2 раза) и у рефрактерных (в 1,6 раза), и превышал показатели нормы в 7,3 раза. При этом у всех пациентов с ДВКЛ до лечения содержание sVEGFR3 в сыворотке крови было выше, чем у доноров, в 4 раза, а после лечения у больных с рецидивами – в 3,6 раза, у рефрактерных пациентов – в 4,5 раза, у пациентов с ремиссией – в 7,3 раза. В результате уровень свободного, активного VEGF-C, рассчитываемый по соотношению VEGF-C/sVEGFR3, оказался у больных до лечения ниже в 4 раза, при этом у больных с неблагоприятным течением заболевания практически не изменился, оставаясь ниже в 4,1 раза по сравнению с доно- рами, а у пациентов с ремиссией стал значимо ниже, чем у больных с рецидивами и рефрактерным течением, – в среднем в 2,6 раза, а по сравнению с донорами – в 10,9 раза.

В ходе исследования не установлены значимые различия в содержании EGF в крови больных ДВКЛ до лечения и в зависимости от исхода лечения, а также по сравнению с показателями здоровых людей. Однако уровень растворимого рецептора sEGFR был ниже по сравнению с показателями нормы у всех больных до лечения в 1,5 раза, а у пациентов с рецидивами и рефрактерным течением в 1,4 и 1,5 раза соответственно. Только у лиц с благоприятным исходом лечения уровень sEGFR в крови нормализовался и был выше в среднем в 1,5 раза по сравнению с больными с неблагоприятным эффектом терапии. В результате было установлено, что уровень биологически активного EGF, рассчитываемый по соотношению EGF/sEGFR, был выше нормы до лечения в 1,9 раза, а после лечения у больных с рецидивами в 1,6 раза, у рефрактерных – в 2,1 раза, не отличаясь от нормы только у лиц с ремиссией.

Определение уровня инсулиноподобных факторов роста в крови показало, что у всех пациентов до лечения показатели были выше нормы: IGF-I в 4,3 раза, а IGF-II в 2,6 раза. Вне зависимости от исхода лечения содержание IGF-I в крови превышало норму: при рецидивах в 4,1 раза, при рефрактерном течении в 4,6 раза и при положительном исходе в 2,8 раза. При этом выявлены значимые различия в концентрации IGF-I у пациентов с положительным эффектом лечения по сравнению с больными с рецидивами (в 1,5 раза) и с рефрактерным течением заболевания (в 1,7 раза) (р˂0,05).

Также не установлена нормализация после лечения уровня IGF-II в крови: у больных с рецидивами его содержание было выше нормы в 3 раза, у рефрактерных больных в 2,2 раза, а при ремиссии в 1,5 раза. Однако у пациентов с последующей ремиссией содержание IGF-II в крови после лечения было значимо ниже по сравнению с рефрактерными больными (в 1,5 раза) и больными с рецидивами (в 2,1 раза).

Наибольший интерес, на наш взгляд, представляло изучение уровня TGFβ1 и его рецептора TGFβR2. Оказалось, что в крови больных ДВКЛ до лечения уровень TGFβ1 был в 2,1 раза выше нормативных показателей, а его рецептора – в 3 раза ниже. Уровень TGFβ1 в крови всех групп больных вне зависимости от исхода лечения был выше, чем в крови доноров: в 2,4 раза при рецидивах, в 1,9 раза у больных с ремиссией и рефрактерных, между собой показатели не имели достоверных отличий. При этом содержание растворимого рецептора sTGFβR2, напротив, было ниже у больных с отрицательным эффектом лечения по сравнению с показателями здоровых доноров: при рецидивах в 3,5 раза, у рефрактерных в 4 раза. Соотношение TGFβ1/TGFβR2, показывающее уровень свободного, активного фактора роста в крови, у больных с неблагоприятным исходом лечения было выше нормы: при рецидивах и рефрак-терности в 8,6 и 7,2 раза, а у пациентов с ремиссией только в 2,3 раза. При этом соотношение TGFβ1/TGFβR2 при благоприятном исходе лечения значимо отличалось от показателей в группе с рецидивами после лечения (в 3,8 раза) и в группе рефрактерных больных (в 3,2 раза).

Обсуждение. Исследование содержания факторов роста при различных солидных опухолях в клинике и эксперименте подтверждает их важную роль в патогенезе злокачественного роста [13, 14]. Есть работы, свидетельствующие о том, что VEGF у больных ДВКЛ участвует не только в неоангиогенезе, но и в ускользании злокачественных клеток от иммунного ответа [15]. Sang et al. при анализе показателей у 65 больных ДВКЛ обнаружили, что у пациентов с повышенным уровнем VEGF была более высокая вероятность экст-ранодального поражения, высокий уровень IPI, двойная экспрессия MYC/BCL2 и высокий уровень Ki-67. Результаты исследования нашей выборки показали, что до лечения у всех больных уровень VEGF-A в сыворотке крови превышал показатели нормы, но была выявлена нормализация этого показателя у пациентов с последующей ремиссией, в отличие от больных с рефрактерным течением заболевания и с ранними рецидивами. Поэтому мы предполагаем, что включение данного иссле- дования у больных ДВКЛ как дополнения к индексу IPI до начала противоопухолевого лечения не имеет смысла, тогда как на этапах проводимой терапии может принести пользу.

Также в качестве возможного маркера ответа на противоопухолевое лечение на его этапах у больных ДВКЛ можно рассматривать отношение EGF к его растворимому рецептору sEGFR. Коэффициент EGF/sEGFR значимо превышал норму у всех пациентов до лечения, а также при неэффективности терапии, но возвращался к показателям нормы у больных с ремиссией. Известно, что EGFR представляет собой рецептор тирозинкиназы, принадлежащий к семейству HER, является ключевым белком в пролиферации эпителиальных клеток и активно экспрессируется при ряде солидных опухолей; кроме того, эпидермальный фактор роста и его рецептор также связывают с резистентностью раковых клеток к химиотерапевтическим агентам. В то же время только единичные исследования при ДВКЛ подтверждают возможность участия данных факторов роста в механизмах резистентности к лечению [16].

Другими маркерами эффективности противоопухолевого лечения в нашем исследовании оказались TGFβ1 с рецептором sTGFβR2 и их соотношение. Обнаружилось, что у всех больных ДВКЛ до лечения уровень TGFβ1 в сыворотке крови был повышен, а концентрация его растворимого рецептора, напротив, снижена, в результате чего соотношение существенно превышало норму. Только у пациентов с положительным ответом на терапию за счет роста уровня растворимого рецептора соотношение TGFβ1/sTGFβR2 значимо снижалось, хотя и превышало показатели у здоровых лиц, тогда как у рефрактерных больных и пациентов с рецидивами данный показатель оставался высоким. Известно, что TGFβ1 активирует неканоническую передачу сигналов SMAD1/5/9 через TGFβR2 в нормальных В-клетках [17]. TGFβ1 является многофункциональным противовоспалительным цитокином, который участвует в различных физиологических процессах, включая контроль клеточного цикла, контроль гемопоэза, дифференцировку клеток, ангиогенез, индукцию апоптоза и фор- мирование клеточного матрикса. В лимфомах экспрессия этого цитокина может быть связана с более агрессивным течением и неблагоприятным прогнозом [18].

Результаты нашего исследования хотя и выявили значимые отличия в содержании IGF-I и IGF-II в сыворотке крови у больных с положительным и отрицательным эффектом терапии, однако не установили полной нормализации их концентрации у пациентов с ремиссией. Единичные исследования роли инсулиноподобных факторов роста в патогенезе ДВКЛ свидетельствуют об их участии в сигнальном пути Hippo-YAP и транскрипционном комплексе YAP/TAZ-TEAD, в результате чего они могут стать потенциальными мишенями для противоопухолевой терапии [19].

Заключение. По результатам настоящего исследования можно говорить не только о повышении уровня ряда факторов роста в крови больных, но и об изменении их биодоступности за счет связывания с растворимыми рецепторами. Изучение содержания в сыворотке крови больных диффузной В-крупноклеточ-ной лимфомой на этапах лечения факторов роста и их рецепторов, входящих в основные пути регуляции неоангиогенеза, лимфангио-генеза, пролиферативных процессов и дифференцировки клеток, позволяет выявить пациентов с последующими рецидивами или рефрактерных к проводимой терапии, международный прогностический индекс IPI у которых предполагал благоприятный ответ на проводимое лечение.

Учитывая общепризнанную гетерогенность диффузной В-крупноклеточной лимфомы, применение малоинвазивного и эффективного метода определения некоторых факторов роста и их рецепторов, в частности TGFβ1 и растворимого TGFβR2, VEGF-A и EGF с растворимым рецептором, у больных ДВКЛ может быть эффективным для прогнозирования течения заболевания, так как на этапах проведенного лечения их концентрация демонстрирует различия между группами больных с последующей ремиссией и рецидивами заболевания, в то время как показатели IPI не всегда являются прогностически значимыми.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов

Концепция и дизайн исследования: Франциянц Е.М., Бандовкина В.А., Куштова Л.Б.

Литературный поиск, участие в исследовании, обработка материала: Куштова Л.Б., Козюк О.В.

Статистическая обработка данных: Бандовкина В.А., Куштова Л.Б.

Анализ и интерпретация данных: Куштова Л.Б., Бандовкина В.А.

Написание и редактирование текста: Куштова Л.Б., Козель Ю.Ю., Дмитриева В.В.