Прогностическое значение экспрессии транскрипционных факторов, фактора роста VEGF, его рецептора, протеинкиназы m-TOR и активности внутриклеточных протеиназ у больных диссеминированным раком почки

Введение. Поиск дополнительных информативных прогностических параметров у больных раком почки является актуальной задачей современной онкологии. Цель исследования. Изучение прогностической значимости экспрессии транскрипционных факторов, фактора роста VEGF, его рецептора, протеинки-назы m-TOR и активности внутриклеточных протеиназ у больных диссеминированным раком почки в соотношении со шкалой MSKCC. Материал и методы. В исследование было включено 40 пациентов с метастатическим почечно-клеточным раком (T_3–4N_0–1M₁). Согласно шкале MSKCC все больные были распределены на 3 группы: с хорошим (n=13), промежуточным (n=26) и неблагоприятным прогнозом (n=1). В дальнейшем анализ касался больных, имеющих хороший и промежуточный прогноз (n=39). Всем пациентам на первом этапе проводилась таргетная терапия пазопанибом или эверолимусом, после которой выполнялась паллиативная нефрэктомия. Содержание транскрипционных и ростовых факторов изучено методом ИФА; активность протеасом и кальпаинов – с помощью флюорометрического метода. Результаты. Исходно высокие уровни экспрессии транскрипционного фактора HIF-1 и ростового фактора VEGF в опухоли почки ассоциированы с хорошим прогнозом заболевания по шкале MSKCC. У этой категории больных на фоне лечения наблюдалось снижение экспрессии транскрипционных факторов HIF-1, NF- κ B р65, NF- κ B р50, ростового фактора VEGF и активности протеасом. Выявленное повышение активности кальпаинов у больных с промежуточным прогнозом было ассоциировано с прогрессированием заболевания. Заключение. Выделены дополнительные молекулярные показатели, повышающие информативность шкалы MSKCC, что позволяет с большей точностью предсказать возможный исход заболевания у больных метастатическим раком почки.

Рак почки представляет собой гетерогенную группу опухолей, из которых более 75 % приходится на светлоклеточный почечно-клеточный тип [14], связанный с мутационными изменениями белка фон Хиппель-Линдау, увеличением содержания ядерного фактора HIF-1, гиперэкспрессией эндотелиального фактора роста (VEGF), активацией тирозинкиназных путей [16] и ключевой серин-треониновой протеинкиназой TOR (m-TOR) [9]. Это позволяет рассматривать данные молекулярные маркеры в качестве основных мишеней. Помимо этого, в патогенезе рака почки важную роль играет фактор транскрипции NF- κ B (nuclear factor kappa-В), который вовлечен в апоптоз и пролиферацию опухолевых клеток [12].

Одним из механизмов регуляции содержания транскрипционных факторов NF- κ B и HIF-1 α является внутриклеточный протеолиз, осуществляемый протеиназами, к числу которых относят протеасомы и кальпаины [1, 2, 4, 18]. В литературе представлены данные о том, что снижение деградации HIF-1α при использовании ингибиторов протеиназ или гипоксии приводит к значительному повышению экспрессии VEGF в опухолевых клетках [20]. Активация транскрипционного фактора NF- κ B также осуществляется при участии протеа-сом [13]. Показана связь экспрессии транскрипционных факторов NF- κ B, HIF-1 и ростового фактора VEGF с активностью и субъединичным составом протеасом у больных раком почки при развитии

гематогенных метастазов [3, 4]. Кроме этого, на культуре почечно-клеточного рака (ПКР) выявлено влияние протеасом на содержание активных компонентов m-TOR сигнального пути [19].

При определении тактики лечения больных метастатическим почечно-клеточным раком значимую роль играют факторы прогноза – патоморфо-логические и клинико-лабораторные показатели, входящие в состав ряда прогностических шкал (прогностическая модель ECOG, номограмма Kattan, шкалы Motzer и HENG) [11, 15]. Наиболее известной и широко используемой для прогнозирования течения заболевания является шкала, разработанная в Мемориальном онкологическом центре Слоан-Кеттеринг MSKCC (МОЦСК/MSKCC), которая включает в себя такие параметры, как соматический статус больного по шкале Карновского, уровень ЛДГ, концентрация скорректированного кальция в сыворотке крови, уровень гемоглобина и наличие в анамнезе нефрэктомии.

Однако далеко не всегда этой информации бывает достаточно для прогноза заболевания, что обусловлено сложными механизмами патогенеза рака почки, поэтому ведется непрерывный поиск дополнительных информативных прогностических параметров [10, 18]. Примером таких исследований может служить шкала Heng, в которую кроме критериев MSKCC были включены такие лабораторные показатели, как количество тромбоцитов и нейтрофилов [7, 11].

Целью исследования явилось изучение прогностической значимости экспрессии транскрипционных факторов, фактора роста VEGF, его рецептора, протеинкиназы m-TOR и активности внутриклеточных протеиназ у больных диссеминированным ПКР и соотношение их со шкалой MSKCC.

Материал и методы

В исследование включено 40 больных (табл. 1) с метастатическим морфологически верифицированным почечно-клеточным раком T3–4N0–1M1 стадий, получавших лечение в отделении общей онкологии Томского НИИ онкологии в период с 2010 по 2013 г. Из них 25 мужчин и 15 женщин. На первом этапе пациентам в течение 2 мес проводилась таргетная терапия препаратами пазопаниб (n=26) по 800 мг или эверолимус (n=14) в дозе 10 мг ежедневно.

Разделение больных на группы согласно шкале MSKCC. В зависимости от прогноза заболевания были выделены группы больных с благоприятным, промежуточным и плохим прогнозом. Оценка проводилась по 5 независимым параметрам. Неблагоприятными факторами считали: статус по шкале Карновского <80 %, уровень лактатдегидрогеназы в 1,5 раза выше нормы, скорректированный кальций крови >10 мг/дл, уровень гемоглобина <130 г/л и отсутствие в анамнезе нефрэктомии. В группу благоприятного прогноза вошли пациенты (n=13), у которых не было ни одного из вышеперечисленных факторов, промежуточного (n=26) – при наличии одного или двух факторов, и неблагоприятного (n=1) – при наличии трех факторов и более [15]. В дальнейшем анализ касался больных, имеющих хороший и промежуточный прогноз (n=39). После

Таблица 1

Клиническая характеристика больных, получавших пазопаниб и эверолимус в предоперационном режиме

Показатель Пазопаниб Эверолимус Кол-во больных Кол-во больных Пол Мужчины 16 (61,5 %) 9 (64,3 %) Женщины 10 (38,5 %) 5 (35,7 %) Средний возраст (мин-макс), лет 56 ± 2,5 (48–73) 54 ± 1,8 (46–70) Местная распространенность Т1 6 (23,1 %) 2 (14,3 %) Т2 10 (38,5 %) 8 (57,1 %) Т3 5 (19,2 %) 3 (21,4 %) Т4 5 (19,2 %) 1 (7,1 %) Поражение регионарных л/узлов N0 19 (73,1 %) 9 (64,3 %) N1 7 (26,9 %) 5 (35,7 %) Метастазы В легкие 20 (76,9 %) 9 (64,3 %) В кости 11 (42,3 %) 7 (50,0 %) В печень 2 (7,6 %) 1 (7,1 %) В контралатеральный надпочечник 1 (3,8 %) 1 (7,1 %) В другие органы 2 (7,6 %) - окончания курса предоперационного лечения проводилась паллиативная нефрэктомия.

Материалом для исследования явились образцы опухолевой ткани, полученные при выполнении диагностической биопсии и радикального оперативного вмешательства, которые после забора замораживались и хранились при температуре –80°С.

Получение гомогенатов. Замороженную ткань (100 мг) гомогенизировали в жидком азоте, затем ресуспендировали в 300 мкл 50 мМ трис-HCl буфера (pH=7,5), содержащего 2 мМ АТФ, 5 мМ хлорид магния, 1 мМ дитиотреитол, 1 мМ ЭДТА и 100 мМ хлорид натрия. Гомогенат центрифугировали 60 мин при 10 000 g и 4^оС.

Определение активности протеасом. Химо-трипсинподобную активность тотального пула протеасом определяли в осветленных гомогенатах опухолевых и неизмененных тканей, а также во фракциях протеасом, по гидролизу флуороген-ного олигопептида N-Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-Amido-4-Methylcoumarin, утилизирующегося химотрипсинподобными центрами протеасом [6], на флуориметре Hitachi-850 (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. Реакционная смесь содержала 20 мМ трис-HCl (pH=7,5), 1 мМ дитиотреитола, 30 мкМ N-Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-Amido-4-Methylcoumarin, 5 мМ хлорида магния и 1 мМ АТФ. Реакцию проводили при 37°С в течение 20 мин и останавливали 1 % додецил сульфатом натрия. Для оценки активности примесных протеаз в образцах применяли специфический ингибитор протеасом – MG132. Удельную активность протеасом выражали в единицах активности на 1 мг белка. Содержание белка определяли по методу Лоури.

Определение активности кальпаинов. Активность кальпаинов определяли в осветленных гомогенатах тканей по методу Sandmann [17]. В качестве субстрата использовали тот же флуорогенный олигопептид N-Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-Amido-4-Methylcoumarin, который был использован для определения активности протеасом. Реакционная смесь содержала 100 мМ Tris-HCl (pH 7,3), 145 мМ NaCl. Реакцию проводили, добавляя к 30 мкМ Suc-LLVY-AMC, растворенному в реакционной смеси, 5 мкл супернатанта, и инкубируя при 25°С в течение 30 мин в присутствии или отсутствии 10 мМ CaCl₂ и 0,4 мкM ингибитора N-ацетил-Leu-Leu-норлейцинал (Sigma) [5].

Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета статистических программ Statistica 8.0. В зависимости от вида распределения результаты представлены как m ± M, где m – среднее выборочное, M – ошибка среднего, или как медиана с интерквартильным размахом (25-й и 75-й процентили). Значимость различий исследовали с помощью t-критерия Стьюдента или критерия Манна – Уитни.

Проведение данной работы одобрено этическим комитетом Томского НИИ онкологии.

Результаты исследования и обсуждение

Данные, характеризующие исходный уровень транскрипционных факторов, а также динамика их изменения на фоне лечения таргетными препаратами у больных с хорошим и промежуточным прогнозом заболевания по шкале MSKCC представлены в табл. 2.

Рис. 1. Содержание ростового фактора VEGF (А) и его рецептора VEGFR2 (Б) в опухоли больных раком почки в зависимости от шкалы MSKCC и этапа лечения. Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с показателями у больных с хорошим прогнозом (р<0,05); # – различия статистически значимы по сравнению с показателями у больных до лечения (р<0,05)

Таблица 2

Экспрессия транскрипционных факторов NF- κ B p65, NF- κ B p50 и HIF-1 α в опухоли больных раком почки в зависимости от шкалы MSKCC и этапа лечения

Прогноз по шкале MSKCC	Содержание NF- κ B p65, УЕ/мг белка в лунке		Содержание NF- κ B p50, УЕ/мг белка в лунке		Экспрессия HIF-1 α , УЕ/мг белка в лунке
	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения
Хороший	20,8 (9,8–37,0)	4,6 (3,96–4,84)#	24,7 (9,8–42,6)	4,0 (3,34–4,9)#	13,08 (6,2–20,5)	1,11 (0,34–1,98)#
Промежуточный	17,9 (6,3–23,0)	9,0 (3,98–16,46)#	10,8 (6,0–32,5)	6,33 (4,0–12,1)	6,35 (3,2–12,7)*	1,0 (0,26–3,6)

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с показателями у больных с хорошим прогнозом (р<0,05); # – различия статистически значимы по сравнению с показателями у больных до лечения (р<0,05).

Таблица 3

Содержание протеинкиназы p-m-TOR в опухоли больных раком почки в зависимости от шкалы MSKCC и этапа лечения

Прогноз по шкале MSKCC	Содержание p-m-TOR, пг/мг белка в лунке
	До лечения	После лечения
Хороший	13,9 (0,0– 20,0)	6,65 (2,15–7,89)#
Промежуточный	12,5 (0–14,3)	15,84 (1,58–21,8)*

Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с показателями у больных с хорошим прогнозом (р<0,05); # – различия статистически значимы по сравнению с показателями до лечения (р<0,05).

Выявлена исходно высокая экспрессия ядер-ных факторов NF- κ B р65 и NF- κ B р50 в опухоли больных обеих групп до начала лечения. В отличие от этих молекулярных показателей уровень транскрипционного фактора HIF-1 α различался в зависимости от прогноза заболевания по шкале MSKCC. Так, исходная экспрессия ядерного фактора в ткани опухоли у пациентов с хорошим прогнозом была в 2 раза выше по сравнению с больными, у которых прогноз был определен как промежуточный.

На фоне проведенной таргетной терапии у больных как с благоприятным, так и промежуточным прогнозом уменьшался уровень NF- κ B р65. Наиболее существенное снижение этих показателей (в 4,5 раза после приема таргетных препаратов) наблюдалось только у больных с хорошим прогнозом по шкале MSKCC. У этих же пациентов отмечено и снижение уровня транскрипционных факторов NF- κ B р50 и HIF-1 α – в 6,1 и 11,8 раза соответственно, в то время как у пациентов с промежуточным прогнозом таких изменений не отмечалось.

Аналогичные данные были получены и в отношении протеинкиназы p-m-TOR. Ее уровень снижался на фоне лечения у больных с хорошим прогнозом в 2 раза и оставался практически равным исходному у пациентов с промежуточным прогнозом (табл. 3).

Содержание ростового фактора VEGF и его рецептора в опухоли больных диссеминированным ПКР в зависимости от прогноза заболевания по шкале MSKCC и этапа лечения представлено на рис. 1. Зафиксирован исходно высокий уровень изучаемого параметра у больных с хорошим прогнозом, который снижался в 6,5 раза на фоне приема таргетных препаратов, тогда как у больных с

Рис. 2. Активность внутриклеточных протеиназ: протеасом (А), кальпаинов (Б) в опухоли больных раком почки в зависимости от шкалы MSKCC и этапа лечения. Примечание: * – различия статистически значимы по сравнению с показателями у больных с хорошим прогнозом (р<0,05); # – различия статистически значимы по сравнению с показателями у больных до лечения (р<0,05)

промежуточным прогнозом подобной динамики не отмечалось. Экспрессия рецептора VEGFR2 имела только тенденцию к снижению, причем более выраженную у больных с хорошим прогнозом.

Активность внутриклеточных протеиназ у больных диссеминированным раком почки также имела ряд особенностей (рис. 2). На фоне приема таргетных препаратов выявлено снижение активности протеасом в 3,33 раза у больных с хорошим прогнозом, при этом активность кальпаинов оставалась неизменной. Динамика изменений активности внутриклеточных протеиназ у больных с промежуточным прогнозом была противоположной: в ткани опухоли активность протеасом на фоне лечения не изменялась, а активность каль-паинов увеличилась в 8,6 раза. При этом известна значимость кальпаинов в активации локомоторных свойств опухолевых клеток [8]. Возможно, в связи с этим фактом можно обсуждать роль кальпаинов в механизмах прогрессирования заболевания у больных с промежуточным прогнозом и рассматривать этот показатель в качестве прогностического.

Таким образом, исходно высокие показатели экспрессии транскрипционного фактора HIF-1,