Проявление спонтанного апоптоза в культуре злокачественных клеток

Актуальность. Активное распространение онкологических заболеваний в настоящее время диктует необходимость проведения исследова- ний, направленных на изучение особенностей функционирования клеток опухоли. Одним из основных критериев, определяющих стабиль- ность развития клеток, является их устойчивость к спонтанному апоптозу. Клеточная культура Нер-2 представляет собой перевиваемую линию клеток карциномы гортани человека и может быть использована при моделировании процесса спонтанного апоптоза в клетках злокачественной опухоли.

Цель исследования. Определение резистентности клеток культуры Нер-2 к спонтанному апоптозу.

Материал и методы. Объектом исследования были клетки культуры Нер-2, которые инкубировали в термостате при температуре 37 ⁰С в среде Игла с гидролизатом лактальбумина, с добавлением L-глутамина и сыворотки крупного рогатого скота. Препараты фиксировали 50 % раствором этанола и окрашивали азур-эозином. Исходная концентрация посадки составляла 100 тыс. клеток культуры Нер-2. Подсчитывали количество клеток, имевших признаки апоптоза. Морфологическими критериями апоптоза считали: фрагментацию ядра с образованием микроядер с собственной ядерной оболочкой, фрагментацию цитоплазмы с отделением от клетки различных по величине фрагментов. Определяли концентрацию апоптозных телец на 100 клеток. В качестве дополнительных критериев (указывающих на адекватность функционирования культуры) определяли митотическую активность и численность клеток в состоянии некроза и дистрофии. Результаты оценивали на 24, 48, 72 и 96-й ч инкубации. Контролем служили культуры, инкубируемые в течение 24 ч.

Результаты. Результаты исследования указывают, что клетки культуры Нер-2 подвергались апоптозу с одинаковой частотой на 24, 48 и 72-й ч инкубации, что составляло 5 % от общего числа клеток. На 96-й ч наблюдения их количество снижалось в 2,2 раза по сравнению с контрольными культурами. Численность клеток с признаками фрагментации цитоплазмы превосходила количество клеток с фрагментацией ядра на все сроки экспозиции, за исключением 96-го ч, когда наблюдали диаметрально противоположную ситуацию. Количество апоптозных телец имело тенденцию к снижению, начиная с

72-го ч инкубации. Число некротизированных клеток прогрессивно увеличивалось, и на 96 ч было больше по сравнению с контрольным параметром в 2,1 раза. Показатели концентрации дистрофически измененных клеток на все сроки наблюдения не имели между собой достоверных различий, они снижались к 72-му ч экспозиции. Максимальные значения митотической активности были зарегистрированы через 72 ч инкубации. Количество клеток в состоянии митоза на указанный срок превосходило контрольный показатель в 3,8 раза.

Из вышесказанного следует, что в культуре Нер-2 отмечали высокую концентрацию клеток в состоянии апоптоза, которая затем уменьшалась. Митотическая активность напротив, сначала нарастала, достигая максимального уровня, и держалась на нем в течение 2 сут, а в дальнейшем (к 96-му ч инкубации) уменьшалась. Разнонаправленное течение указанных процессов, возможно, способствует поддержанию баланса между погибшими и новообразованными клетками, который оставался отрицательным на все сроки наблюдения. Большинство апоптозных клеток Нер-2 имели фрагментированную цитоплазму. Наивысшую концентрацию апоптозных телец находили через 48 ч от начала инкубации. Клетки подвергались некрозу одинаково часто на все сроки культивирования, за исключением повышения их содержания через 96 ч. Численность дистрофически поврежденных клеток на 72-й ч инкубации имела тенденцию к снижению.

Выводы. Таким образом, были выявлены морфологические различия и динамические изменения в активности течения апоптоза в культуре Нер-2 в зависимости от длительности инкубации. Баланс между погибшими и новообразованными клетками был отрицательным на ранних сроках наблюдения. Полученные результаты целесообразно использовать при моделировании in vitro процесса апоптоза в клетках опухоли при проведении различного рода прикладных и теоретических исследований, связанных с разработкой методов своевременной диагностики злокачественных новообразований.