Пролиферативная активность и клеточный цикл лимфоцитов периферической крови (ЛПК) человека в отдалённые сроки после хронического радиационного воздействия

Анализ данных, полученных при длительном наблюдении за жителями прибрежных сёл р. Теча, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному облучению, выявил угнетение гемопоэза у отдельных лиц в ранние сроки облучения. Наличие стойких выраженных изменений в гемопоэзе (цитопения, гипоплазия костного мозга) в сочетании с неврологическими и иммунологическими изменениями позволило диагностировать у лиц, облучённых в дозе 0,7 Гр и более, хроническую лучевую болезнь (ХЛБ). Гибель и задержка дифференцировки гранулоцитарных предшественников на ранних этапах облучения людей были главными причинами ранней лейкопении. По результатам текущих медицинских осмотров у 8 % облучённых жителей прибрежных сёл р. Теча, лейкопения регистрируется и в настоящие время (через 60 лет от начала облучения) [1, 6].

Кроме того, в отдалённые сроки у облучённых людей, проживающих в прибрежных сёлах р. Теча, сохраняется повышенная частота мутаций в гене Т-клеточного рецептора (TCR) [5], а также нестабильных (дицентриков, кольцевых хромосом) и стабильных хромосомных аберраций (транслокаций) [6].

Представлялось интересным оценить особенности клеточного цикла у жителей прибрежных сёл р. Теча в период формирования отдалённых цитопений, когда мощность дозы облучения не превышала допустимой. Единичные экспериментальные данные указывают на снижение пролиферативной активности Т-лимфоцитов мышей в отдалённый период хронического облучения в малых дозах [2].

Таким образом, цель данного исследования – оценить состояние клеточного цикла и пролиферацию лимфоцитов периферической крови человека в отдалённые сроки после хронического радиационного воздействия.

Методы исследования

В результате сброса отходов радиохимического производства ПО «Маяк» в речную систему Теча-Исеть-Тобол с 1950 по 1956 гг., население прибрежных сёл р. Теча (более 30 тыс. человек) подверглось облучению в широком диапазоне доз (максимальная доза облучения ККМ в соответствии с TRDS-2009 достигала 9 Гр) [8]. Наибольшая мощность дозы наблюдалась в первые 6 лет, при этом максимальная эквивалентная доза комбинированного внешнего и внутреннего облучения ККМ достигала 0,4-0,5 Зв/год в сёлах верхнего течения р. Теча. Около 87 % накопленной дозы внутреннего облучения приходилось на долю остеотропного 90Sr [5]. Данный факт позволяет рассматривать костную ткань и ККМ в качестве органов-мишеней радиационного воздействия у жителей прибрежных сёл р. Теча.

Состояние клеточного цикла и пролиферативную активность ЛПК оценивали у 136 жителей прибрежных сёл р. Теча, подвергшихся хроническому облучению. Контрольную группу составили 59 человек, проживающих на незагрязнённых территориях и имеющих нормальный клеточный состав крови. Средняя накопленная доза на ККМ в группе облучённых лиц составила 1,15 Гр (максимальные индивидуальные значения достигали 4,46 Гр). Средний возраст в сравниваемых группах, на время обследования, составил 68,8 лет. Группы были сходны по национальному составу и полу. Из исследования исключались лица, принимавшие антибиотики, цитостатики, проходившие рентгеновское обследование в течение последних 6 месяцев. Среди обследованных облучённых людей были выделены 2 подгруппы жителей, которые имели изменения со стороны гемопоэза в ранний и отдалённый периоды от начала облучения (группа лю- дей, перенесших ХЛБ и группа облучённых людей с лейкопенией). Группа людей, перенесших ХЛБ, включала 31 человека, а группа людей с отдалённой лейкопенией – 30 человек. Критерием отбора людей с лейкопенией было устойчивое снижение абсолютного количества лейкоцитов периферической крови - менее 4,0х109/л.

Объектом исследования были выбраны ЛПК. Это обусловлено доступностью материала, высокой концентрацией клеток (10⁶/л) в периферической крови, синхронностью фаз клеточного цикла (клетки находятся в G0-фазе), а также степенью радиочувствительности, близкой к радиочувствительности стволовых кроветворных клеток (СКК) [9]. ЛПК выделяли по стандартной методике на градиенте фиколл-урографина [10]. Полученную суспензию клеток делили на 5 равных частей, 2 из которых были предназначены для оценки спонтанного (исходного) уровня пролиферирующих клеток и клеток с задержкой клеточного цикла. Следующие 3 части предназначались для анализа исследуемых параметров после инкубации культуры ЛПК. Клетки инкубировали по стандартной методике [3] в культуральной среде с добавлением ФГА. Для оценки пролиферативной активности клеток (доли/процент/ клеток, ответивших на митогенный стимул), культуру лимфоцитов инкубировали при 37 ° С 42 часа [20]. Для выявления клеток с задержкой клеточного цикла в сверочной точке G1/S, культуру лимфоцитов инкубировали при 37 ° С 24 часа. Еще одну пробирку с культурой ЛПК культивировали 22 часа [20], затем подвергали у -облу-чению в дозе 1 Гр, и снова инкубировали еще 2 часа для накопления клеток с задержкой клеточного цикла.

Для оценки пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови использовали маркер пролиферации – белок ki-67 [14, 16]. По литературным данным, большинство клеток, подвергшихся воздействию у -излучения, останавливаются в G1- или G2-фазе [17, 19]. Поэтому для исследования клеточного цикла была выбрана первая сверочная точка G1/S, маркером активации которой является белок Chk2 [11, 12, 17, 19].

Белки (ki-67 и Chk2) окрашивали по методике иммунофлюоресцентного окрашивания внутриклеточных белков [14] с применением FITC-меченных моноклональных антител anti-Chk2 (Beckton Dickenson, США) и anti-ki-67 (Beckton Dickenson, США). Анализ проводили на проточном цитофлуориметре серии EPICS XL-MCL (аргоновый лазер 488 нм мощностью 15 мВт). Статистический анализ результатов проводили с использованием пакета программ «Micrsoft Excel» и «Statistica 6.0».

Результаты исследования

Исследование пролиферативной активности ЛПК облучённых людей. Анализ пролиферативной активности ЛПК показал (табл. 1), что в отдалённые сроки от начала облучения у лиц, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации, исходный уровень пролиферирующих ЛПК в среднем составил 2,86 %. В группе сравнения данный показатель был равен 2,32 %. Полученные значения пролиферирующих клеток соответствовали описанной в литературных источниках норме [16]. В группе облучённых лиц, перенесших ХЛБ, доля пролиферирующих клеток была выше значений контроля (3,68 %), но не достигала статистической значимости. Тогда как у облучённых людей с лейкопенией доля пролиферирующих клеток была достоверно выше контроля – 4,20 % (p=0,02).

Таблица 1

Доля (%) лимфоцитов периферической крови , экспрессирующих белок ki-67, у облучённых и необлучённых людей

Группы	Спонтанный уровень	Инкубация 42 часа
	M±m	M±m
Облучённые люди n=88	2,81±0,33 (0,08-12,62)	12,82±0,90 (2,56-39,82)
Люди , перенесшие ХЛБ n=22	3,68±0,90 (0,22-12,12)	13,65±2,51 (2,56-36,60)
Облучённые люди с лейкопенией n=25	4,20±0,70 (0,08-12,65) p=0,02	15,14±2,0 (4,08-37,46) p=0,1
Контроль ( необлучённые люди ) n=20	2,32±0,65 (0,05-11,83)	10,83±1,71 (0,94-26,42)

Примечание: р – различия с контролем.

После инкубации культуры лимфоцитов с митогеном (ФГА) доля пролиферирующих лимфоцитов увеличилась во всех изучаемых группах. Так, у облучённых людей доля пролиферирующих лимфоцитов составила 12,82 %, а в группе сравнения – 10,83 %. Несмотря на увеличение доли пролиферирующих клеток у людей, перенесших ХЛБ (13,65 %), по сравнению с контролем (10,83 %), достоверных различий отмечено не было. Только у людей с лейкопенией наблюдалась тенденция к увеличению доли пролиферирующих клеток (15,14 %, p=0,1) по сравнению с контролем.

Исследование клеточного цикла облучённых людей. Анализ уровня ЛПК, экспрессирующих белок Chk2, выявил увеличение доли клеток с блоком клеточного цикла у облучённых людей (0,75 %, p=0,02) по сравнению с контролем (0,40 %). Еще более высокий процент таких клеток был отмечен у облучённых лиц с лейкопенией (1,06 %, p=0,01). Несмотря на превышение доли клеток с блоком клеточного цикла у людей, перенесших ХЛБ (0,71 %), при сравнении с группой контроля достоверных различий не отмечено. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2 Доля (%) лимфоцитов периферической крови , экспрессирующих белок Chk2, у облучённых и необлучённых людей

Исследуемые группы	Исходный уровень	Инкубация 24 ч	Инкубация 22 ч + облучение + инкубация 2 ч
	M±m	M±m	M±m
Облучённые люди n=136	0,75±0,09 (0-6,37) p=0,02	2,87±0,43 (0,27-17,80)	3,08±0,28 (0,14-16,75)
Люди , перенесшие ХЛБ n=31	0,71±0,20 (0,03-5,42)	2,90±0,51 (0,36-11,36)	2,82±0,42 (0,14-9,64)
Облучённые люди с лейкопенией n=30	1,06±0,23 (0,04-5,82) p=0,01	4,12±0,75 (0,29-17,0)	2,94±0,56 (0,54-11,38)
Контроль ( необлучённые люди ) n=59	0,40±0,05 (0-1,65)	3,19±0,48 (0,15-13,12)	3,36±0,52 (0,22-15,84)

Примечание: р – различия с контролем.

После стимуляции клеток к делению и инкубации отмечено увеличение количества клеток с блоком G1/S в среднем на 2,5 %, но достоверных различий при сравнении всех групп облучённых людей (перенесших ХЛБ и имеющих лейкопению) с группой контроля получено не было. Аналогично, не выявлено различий между группами облучённых людей (перенесших ХЛБ и имеющих лейкопению) и контрольной группой после стандартного дополнительного γ -облуче-ния культуры лимфоцитов в дозе 1 Гр.

Проведённый статистический анализ зависимости «доза-эффект» как у облучённых людей с лейкопенией и перенесших ХЛБ, так и у облучённых лиц с нормальными показателями крови, не выявил линейной зависимости между дозой облучения ККМ и изучаемыми параметрами.

Зависимость абсолютного количества лейкоцитов периферической крови облучённых людей от пролиферативной активности и состояния клеточного цикла. Проведённый корреляционный анализ не выявил зависимости между абсолютным количеством лейкоцитов периферической крови и абсолютным количеством спонтанно пролиферирующих лимфоцитов в группе всех облучённых лиц (r=0,006; p=0,9). Отмечена положительная линейная зависимость между абсолютным количеством лейкоцитов периферической крови у облучённых людей и абсолютным количеством пролиферирующих лимфоцитов после их инкубации с ФГА (r=0,25; p=0,02) (рис. 1).

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8   3,0

Абсолютное количество пролиферирующих ЛПК (10⁹/ л ) после инкубации с ФГА

Рис . 1. Зависимость абсолютного количества лейкоцитов периферической крови облучённых людей в отдалённый период (от начала облучения) от абсолютного количества пролиферирующих ЛПК (10⁹/л) после инкубации с ФГА.

У людей с лейкопенией корреляционный анализ не выявил зависимости абсолютного количества лейкоцитов от абсолютного количества пролиферирующих лимфоцитов (r=0,3; p=0,2). Также не обнаружено зависимости между абсолютным количеством пролиферирующих лимфоцитов и абсолютным количеством лейкоцитов периферической крови облучённых людей, перенесших ХЛБ (r=0,4; p=0,2).

Корреляционный анализ также не позволил отметить зависимости абсолютного количества лейкоцитов периферической крови от абсолютного количества ЛПК с задержкой клеточного цикла у всех облучённых людей (r=0,06; p=0,4), у лиц, перенесших ХЛБ (r=0,1; p=0,5), и у облучённых людей с лейкопенией (r=0,1; p=0,6).

Обсуждение

Исследование ЛПК, экспрессирующих белок Chk2, у облучённых людей в отдалённый период от начала воздействия ионизирующего излучения, позволило отметить увеличение доли клеток с блоком клеточного цикла, которое, вероятно, является результатом повреждения ДНК. Наибольшее количество клеток с задержкой клеточного цикла наблюдалось у людей с отдалённой лейкопенией.

Увеличение доли клеток с повреждением ДНК (оцененное по уровню белка Chk2) у облучённых людей в отдалённый период после начала облучения может свидетельствовать о нестабильности генома кроветворных клеток, включая СКК. Это предположение подтверждается данными in vitro, полученными в культурах клеток, свидетельствующими о радиационно-индуцированной нестабильности генома, возникающей у потомков облучённых клеток в отдалённые сроки после радиационного воздействия [4, 15]. В пользу этого предположения свидетельствуют ранее полученные результаты по оценке уровня нестабильных геномных мутации и хромосомных аберраций у хронически облучённых жителей прибрежных сёл р. Теча. Как отмечалось выше, в этих исследованиях было показано увеличение уровня мутаций в гене Тр53 [5], соматических мутаций (TCR) [5], хромосомных аберраций [6] у облучённых людей в отдалённый период от начала облучения.

Несмотря на достоверное увеличение доли клеток с блоком клеточного цикла (исходном уровне) у облучённых людей, после митогенной стимуляции культуры лимфоцитов и митогенной стимуляции совместно с облучением, доля клеток с блоком G1/S оставалась на уровне контрольных значений. Данный факт позволяет сделать заключение о нормализации процессов репарации у облучённых людей.

Исследование пролиферативной активности ЛПК облучённых людей в отдалённые сроки от начала облучения не выявило количественных изменений пролиферирующих клеток при сравнении со значениями у необлучённых людей. Однако значимое увеличение доли пролиферирующих ЛПК было отмечено у облучённых людей с лейкопенией. Тенденция к увеличению клеток, экспрессирующих белок ki-67, у облучённых людей с лейкопенией сохранилась после инкубации культуры лимфоцитов с ФГА. Вероятно, увеличение доли пролиферирующих кроветворных клеток обусловлено компенсаторными реакциями организма в ответ на снижение количества форменных элементов крови.

Обнаружена зависимость между абсолютным количеством лейкоцитов периферической крови облучённых людей и абсолютным количеством клеток, ответивших на митогенную стимуляцию делением (пролиферативный потенциал). Этот факт позволяет предположить, что абсолютное количество лейкоцитов крови у хронически облучённых людей зависит от пролиферативного потенциала СКК. Однако, у людей с лейкопенией такой зависимости не наблюдалось, что позволяет предположить снижение пролиферативного потенциала кроветворных клеток у этих лиц.

Проведённый статистический анализ зависимости «доза-эффект» у облучённых людей с отдалённой лейкопенией, и у людей, перенесших ХЛБ, а также у облучённых людей с нормальными показателями крови не выявил корреляции между дозой облучения ККМ и изучаемыми параметрами.

Таким образом, данные, полученные в результате проведённого исследования, позволяют предположить, что увеличение доли клеток с блоком клеточного цикла и их элиминация могут быть одной из причин развития лейкопении (вследствие возникающего дефицита клеток). Также увеличение пролиферативной активности ЛПК повышает вероятность малигнизации клеток и, как следствие, повышает риск развития лейкозов.

Выводы

• 1.    В отдалённые сроки после хронического радиационного воздействия у облучённых жителей прибрежных сёл р. Теча (средняя накопленная доза облучения ККМ составила 1,15 Гр) выявлено увеличение относительного количества лимфоцитов периферической крови с задержкой клеточного цикла на стадии G1/S.

• 2.    Наибольшее увеличение относительного количества лимфоцитов периферической крови с задержкой клеточного цикла отмечено у облучённых людей с лейкопенией в отдалённые сроки после хронического радиационного воздействия.

• 3.    У облучённых людей с лейкопенией в отдалённые сроки после хронического радиационного воздействия отмечено увеличение спонтанно пролиферирующих лимфоцитов периферической крови.