ПРОСТЕЙШИЙ КОМПЛЕКТ ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ НАНЕСЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДОВ МЕТАЛЛОВ НА МАЛДИ-МИШЕНЬ ПРИ БЕСКАПЕЛЬНОМ ЭЛЕКТРОРАСПЫЛЕНИИ В НОРМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ

Значительные усилия исследователей в области металл-аффинной хроматографии направлены на уменьшение количества образца, требуемого для анализа, и снижение потерь на сорбенте при проведении металл-аффинной хроматографии. Появились работы, в которых манипулируют очень малыми объемами образца, а пробопод-готовка сведена к нескольким простым этапам — так называемая "лаборатория на мишени" [1]. Покрытая или модифицированная слоем сорбента — наночастицами оксидов различных металлов — мишень может использоваться для прямого обогащения образца in situ с последующим анализом методом масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/иони-зацией (МАЛДИ-МС).

Для нанесения слоя сорбента на мишень разработаны и апробированы несколько методик модификации мишени, использующих набор приборов и устройств для нанесения сорбентов. Методики реализуются с использованием электрораспыления суспензии металл-аффинного сорбента на основе окисей металлов в водно-метанольном растворе. Отличаются методики способами подготовки поверхности МАЛДИ-мишени, условиями процесса напыления, температурным режимом и многоэтапностью процесса [2–5]. Разработанные и реализованные методики модификации мишени основаны на использовании лабораторных установок, которые зачастую довольно сложны и дорогостоящи.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ

Относительно простой лабораторной установкой можно было бы считать описанную и испытанную в [6], которая состоит из 20 элементов и устройств. Результаты исследований бескапельного электрораспыления растворов и суспензий при нормальных условиях [7] позволили не только упростить лабораторную установку [6], но и сделать ее значительно дешевле без потери качества результатов.

ПРЕДЛАГАЕМОЕ РЕШЕНИЕ

Описание конструкции

На рис. 1 представлена схема упрощенной лабораторной установки для нанесения сорбентов — наночастиц оксидов различных металлов — на металлическую подложку. Лабораторная установка состоит из трех основных узлов: инфузионной системы (капельницы); узла бескапельного электрораспыления растворов при атмосферном давлении и системы обеспечения, включающей в себя управляемые элементы: высоковольтный блок питания, механический воздушный насос с блоком питания, а также МАЛДИ-мишени для нанесения на ее поверхность механически устойчивого пятна сорбента. Инфузионная система состоит из: камеры капельницы 1, регулятора скорости инфузии 2 — подвижного колеса-зажима внутри каретки, и пластиковых трубок 3.

Рис. 1. Схема упрощенной лабораторной установки для нанесения сорбентов — наночастиц оксидов различных металлов на металлическую подложку.

Здесь: камера капельницы 1, регулятор скорости инфузии 2, пластиковые трубки 3, металлический капилляр 4 диаметром 0.8 мм, внешний диэлектрический капилляр 5, воздушный насос 6 — R385 6-12V DC, блок питания воздушного насоса 7, регулируемый высоковольтный блок питания 8 Applied Kilovolts, заземленная гладкая металлическая съемная пластина 9, МАЛДИ-мишень 10

Суспензия наночастиц оксида металла в водном растворе метанола заливается в капельницу и по пластиковой трубке поступает к регулятору скорости инфузии — объемной скорости подачи суспензии в систему. Выбранный поток суспензии от регулятора скорости потока по пластиковой трубке поступает в металлический капилляр 4 диаметром 0.8 мм узла бескапельного распыления раствора при атмосферном давлении при нормальных условиях, который подробно описан в работах [6–10].

Коаксиально к капилляру 4 расположен внешний диэлектрический капилляр 5 с внутренним диаметром, большим внешнего диаметра капилляра 4. Излишки нераспыленного раствора, смачи- вающие внешнюю стенку капилляра 4, вместе с лабораторным воздухом откачиваются воздушным насосом 6 R385 6-12V DC через зазор между капиллярами 4 и 5. Механический воздушный насос управляется блоком питания 7.

Откачанная по коаксиальному каналу излишняя парогазовая смесь из механического насоса поступает в камеру капельницы, где происходит барботирование исходной суспензии, что не позволяет сорбенту осаждаться на дно. Металлический капилляр узла распыления подключается к регулируемому высоковольтному блоку питания 8 Applied Kilovolts. Для реализации режима электрораспыления в качестве противоэлектрода используется заземленная металлическая пластина, а                                             б

Рис. 2. Распыление нанопорошка TiO 2 на полированную МАЛДИ-мишень.

а — фотография узла для распыления: мениск распыляемой суспензии в бескапельном режиме 1, торец металлического капилляра 2, внешний диэлектрический капилляр 3, сухое механически устойчивое пятно из сорбента 4;

б — микрофотография ячейки мишени с распыленным нанопорошком TiO 2 , полученная методом оптической микроскопии;

в — микрофотография распыленного TiO2, полученная методом СЭМ

в

которой может быть либо гладкая съемная пластина 9 для настройки режима напыления сорбента, либо МАЛДИ-мишень 10 для получения необходимого пятна сорбента и реализации методики "лаборатория на мишени". Расстояние между торцом металлического капилляра и противоэлектро-дом составляет порядка 10 мм.

Описание работы установки

Режим бескапельного распыления можно контролировать визуально. На рис. 2, а, показаны: 1 — мениск распыляемой суспензии в бескапель-ном режиме, 2 — торец металлического капилляра и 3 — внешний диэлектрический капилляр. В случае существования микрокапель в факеле распыления на противоэлектроде образуется "роса" из распыляемого раствора, в случае бескапельного распыления на противоэлектроде образуется сухое механически устойчивое пятно из сорбента 4.

Скорость откачки потока лабораторного воздуха механическим насосом регулируется блоком питания. На металлический капилляр подается регулируемое высоковольтное напряжение до 5 кВ. Полярность напряжения распыления зависит от полярности распыляемых частиц сорбента и растворителя.

ЭКСПЕРИМЕНТ

Апробация упрощенной лабораторной установки для нанесения сорбентов — наночастиц оксидов различных металлов на металлическую подложку проведена в случае распыления нанопорошка TiO 2 (размер частиц ~21 нм, Sigma-Aldrich). Использовали суспензию в 30% водном метаноле с 0.1% муравьиной кислотой с концентрацией частиц 5 мг/мл. Суспензию предварительно перемешивали с помощью перемешивающего устройства типа

"Вортекс", затем в течение 10 мин выдерживали в ультразвуковой ванне.

Для получения пятна сорбента диаметром 2 мм использовались следующие параметры распыления: сила тока 133 нА; расстояние между мишенью и иглой ~5 мм; игла выдвинута из корпуса на 0.7 мм; шприц с суспензией закреплен на штативе на 70 см выше уровня стола; рабочий объем суспензии не менее 20 мл; постоянный объем суспензии в шприце не менее 5 мл; время распыления 10 мин.

Методом оптической микроскопии было установлено, при таких параметрах удается получить достаточно ровное покрытие, более уплотненное по краям пятна (рис. 2, б). При этом частицы материала достаточно плотно упакованы, что подтверждалось результатами исследования с использованием сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) (рис. 2, в).

На следующем этапе полученные пятна TiO 2 были использованы для проведения металл-аффинной экстракции в формате "лаборатория на мишени". Недавно было показано, что металл-аффинная хроматография позволяет проводить обогащение образца галогенсодержащими соединениями [11–13]. Поэтому в качестве образца был

Рис. 3. МАЛДИ масс-спектры триптического гидролизата глобина человека, модифицированного N 1-(4-хлорфенил)-2-хлорацетамидом.

а — до обогащения; б — несвязавшаяся фракция; в — после обогащения на пятне распыленного TiO 2

выбран триптический гидролизат глобина человека, модифицированного N 1-(4-хлорфенил)-2-хлорацетамидом (CCAn) таким образом, чтобы соотношение модифицированной формы к немо-дифицированной составляло 1:10. В этом случае, как показано на рис. 3, а, соотношение сигнал/шум (S/N) сигнала, соответствующего аддукту глобина человека с CCAn (LLGNVLVC СAn VLAHHFGK, m/z 1886.993, разница масс с немодифицирован-ным пептидом 167 Да), не превышало 4. Металл-аффинную экстракцию проводили при следующих условиях:

• •    сорбент — напыленные пятна TiO 2 ;

• •    сорбция — в водной среде при рН 6 в течение 20 мин (несвязавшуюся фракцию после переносили на свободную ячейку мишени и смешивали с раствором матрицы);

• •    промывка — дважды дистиллированной водой;

• •    десорбция — 30% водным ацетонитрилом в присутствии матрицы (альфа-циано-4-гидроксикоричная кислота) в 70% водном ацетонитриле с 0.1% трифторуксусной кислотой.

Все элюенты высушивались непосредственно на пятне сорбента. Анализ проводили с помощью тандемного времяпролетного масс-спектрометра, оснащенного источником ионов МАЛДИ, Ultraflextreme (Bruker Daltonics), на базе ресурсного центра "Развитие молекулярных и клеточных технологий" Научного парка СПбГУ. Спектры регистрировали в диапазоне m/z 1000–3000 в режиме "рефлектрон" с детектированием положительных ионов при следующих настройках масс-спектрометра: напряжения 1 и 2 на источнике равны 20.1 и 18.0 кВ соответственно; напряжение на линзах — 7.0 кВ; напряжение на рефлектроне 1 — 21.1 кВ; напряжение на рефлектроне 2 — 10.9 кВ.

При указанных условиях проведения анализа аддукт полностью связывается с сорбентом, о чем свидетельствует отсутствие сигнала с m/z 1886.993 в масс-спектре несвязавшейся фракции (рис. 3, б). При этом в масс-спектре, полученном с пятна сорбента, искомый сигнал оказался одним из наиболее интенсивных наряду с сигналом, соответствующим немодифицированному пептиду LLGNVLVCVLAHHFGK (рис. 3, в).

ВЫВОДЫ

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что TiO2, нанесенный на поверхность мишени методом бескапельного электрораспыления, сохраняет свойства металл-аффинного сорбента, а предложенный подход в формате "лаборатория на мишени" может быть использован для экстракции галогенсодержащих белковых аддуктов.

Таким образом, установлено, что простейший комплект оборудования для нанесения наночастиц оксидов металлов на МАЛДИ-мишень при беска-пельном электрораспылении в нормальных условиях позволяет получать ровные устойчивые покрытия на поверхности твердой подложки при 100% использовании суспензии. На примере TiO 2 показано, что электрораспыление в указанных условиях не приводит к изменению свойств ме-талл-аффинного сорбента. Кроме того, продемонстрировано, что формат "лаборатория на мишени" может быть использован для экстракции галогенсодержащих белковых аддуктов.

Работа выполнена в Институте аналитического приборостроения Российской академии наук в рамках темы FFZM-2022-0009 (номер гос. регистрации 122040600002-3) государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации № 075-01157-23-00 (от 29.12.2022).