Протеазная активность Bacillus hemicellulosolyticum

Щелочные гидротермы Байкальского региона являются экстремальными экосистемами, в которых активно развиваются термофильные аэробные алкалофильные и алкалотолерантные бактерии [2].

В естественных условиях обитания бактериям, как правило, необходимо секретировать разнообразные внеклеточные ферменты, которые разрушают сложные природные органические вещества. Большинство секретируемых ферментов бактерий являются гидролазами, действующими на полисахариды, белки, липиды и нуклеиновые кислоты. Секретируемые гидролазы бактерий в последние годы вызывают все больший интерес как модельные объекты при исследовании отдельных регуляторных процессов и как перспективные для промышленного использования ферменты. В частности, протеазы широко используются в биотехнологии, в молекулярной биологии, находят применение в различных биохимических исследованиях и медицине [3]. Особенно перспективным является применение ферментов бактерий, так как бактерии обладают широким набором различающихся по субстратной специфичности протеаз.

Целью данного исследования явилось изучение протеазной активности культуры Ur-6, выделенной из щелочного источника Уро (Северное Прибайкалье).

Объекты и методы исследования

В качестве источника секретируемых протеолитических ферментов использовали культуральную жидкость культуры Ur-6, выделенную из микробного мата горячего источника Уро. Выделенный штамм Ur-6 относится к представителю рода Bacillus . Наибольшее сходство у культуры Ur-6 выявлено с Bacillus hemicellu-losolyticum C-11 (99%).

Определение внеклеточной протеазной активности в культуральной жидкости у изученных культур проводили по методу Эрлангера с соавт. [4], используя 5 мМ пара-нитроанилидные субстраты протеаз– трипсиноподобных, химотрипсиноподобных, субтилизиноподобных, цистеиновых и аминопептидаз (BAPA, GlpFpNA, GlpAALpNA, GlpFApNA и TpNA, ApNA, LpNA, соответственно), и на белковом субстрате азоказеине, используемом для определения общей активности. Для изучения влияния различных белков на секрецию протеаз к среде Пфеннига добавляли следующие белки (в конечной концентрации 1%): казеин, желатин, пептон, чтобы изучить зависимость секреции ферментов от суток культивирования культуральную жидкость отбирали через 12, 24, 36 и 48 ч. В работе использовались ингибиторы металлопротеаз – этилендиаминтетраацетат Na (ЭДТА), цистеиновых протеаз – иод-ацетамид (ИAA) и сериновых протеаз – фенил-метилсульфонилфторид (ФМСФ) [1].

Результаты исследования

Культура Ur-6 была исследована на способность секретировать внеклеточные протеазы на различных синтетических субстратах. Была изучена динамика накопления протеолитической активности в процессе роста культуры. Определение субстратной специфичности показало, что изученный штамм не гидролизует субстраты, специфичные для химотрипсинподобных и цистеиновых протеиназ, независимо от времени культивирования (до 60 ч) и источников органического азота (триптон, казеин и желатин). Результаты исследования зависимости активности протеиназ от температуры культивирования показали, что наиболее высокая активность на субстрате для субтилизиноподобных протеиназ обнаружена при 500С. При этой температуре максимальная удельная активность у культуры Ur-6 обнаружена на 12 ч культивирования и составила 3,24 ед/мг.

В целом отмечено, что культура Ur-6, кроме субтилизиноподобной, обладает высокой аминопептидазной активностью. Характерно, что наибольшая активность по субстрату для субти-лизиноподобных протеиназ обнаружена на среде с триптоном. Добавление в среду желатина или казеина приводило к слабой индукции суб-тилизиноподобных протеиназ.

Выделение протеолитических ферментов проводили из культуральной жидкости, процедура очистки внеклеточных протеаз у штамма Ur-6 включала несколько последовательных стадий.

На первой стадии белки культуральной жидкости осаждали сульфатом аммония (80% насыщения). На следующей стадии очистки использовали метод ионообменной хроматографии с использованием колонки Mono Q. Предварительно перед нанесением на колонку белки обессоливали и концентрировали в ячейке «Амикон» с мембраной РМ-10 при 40С (рис. 1). Третьей стадией очистки стала гель-хроматография на колонке Superdex–75. Активность фермента определяли по субстрату субти-лизиноподобных протеиназ – GlpAALpNA. В результате внеклеточная протеиназа штамма Ur-6 была очищена с выходом 10%.

Степень очистки протеазы из культуральной жидкости на различных стадиях выделения представлена в таблице 1.

ч / з ночь

А280 нм

1,6

1,4

1,2

0,8

0,6

0,4

0,2

,2

Ъ Л

,4

,45

0,8

0,9 0,85

0,95

0,14

0,12 0,1

0,08

0,06

0,04

0,02 0

активность

NaCl белок

9 ^ <ь ^ n% # ^

номер фракции

Рис . 1. Гель-фильтрация культуры Ur-6 на Сефадексе G-50

Степень очистки протеазы, активной по БАПА, секретируемой A.alternata на 5 сутки культивирования

Таблица 1

Стадия очистки	Кол-во белка в 1 мл	Кол-во белка, мг во всем материале	Общий объем после процедуры, мл	Общая активность, ед	Удельная активность	Ст. очистки	Выход, %
Культуральная жидкость	10,9	10900	1000	18	1,65	1	100
КЖ после осаждения сульфатом аммония	3,43	37,7	11	869	253,4	153	53
Концентрирование на ячейке Ami-con (Ионообменная хроматография МоноQ)	0, 229	2,26	9,9	188,1	821	497	45,1
Гель-фильтрация	0,027	1,35	49,9	36	1333	807	9,98

Проведенный нами анализ функциональных GlpAALpNA у культуры Ur-6 подавляется спе-групп активного центра показал, что активность цифическим ингибитором сериновых протеиназ

внеклеточных

протеиназ по субстрату   – фенилметилсульфонилфторидом (ФМСФ). Таблица 2 Ингибиторный анализ функционального центра

Ингибитор	Ур-6
ФМСФ 1 (ст.)	9,7
ЕДТА	94
IAA	100
ДТТ	96
Спирт	98

Ингибиторы цистеиновых протеиназ – йодацетамид (ЙАА) и металлопротеиназ – этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) либо совсем не оказывали влияния на активность, либо подавляли активность в незначительной степени (табл. 2). Представленные данные вместе с данными о предпочтительном субстрате исследуемых ферментов позволяют отнести их к классу сериновых протеиназ субтилизиноподобного типа.