Протеинфосфатаза 1В в патогенезе рака гортани и гортаноглотки

Внедрение в клиническую практику высокоэффективных цитостатических препаратов, а также появление новых схем полихимиотерапии с их использованием способствуют значительным достижениям в лечении злокачественных новообразований. В частности, комбинация таких цитостатических препаратов, как цисплатин и этопозид, является стандартным режимом химиотерапии для пациентов с мелкоклеточным раком легкого [1]. Одним из основных побочных эффектов полихимиотерапии является депрессия эритроидного ростка кроветворения, вследствие чего возникает анемия, которая ухудшает общее состояние и переносимость инфекций онкологическими пациентами и ограничивает продолжительность цитостатического лечения. Для коррекции анемии в настоящее время широко применяется рекомбинантный эритропоэтин. Этот цитокин стимулирует выживание, пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических клеток эритроидного ростка кроветворения в костном мозге. Наряду с высокой эффективностью эритропоэтина его применение часто сопровождается побочными эффектами: гипертоническим кризом с явлениями энцефалопатии, тромбоцитозом, снижением сывороточных показателей обмена железа, кожными аллергическими реакциями. Необходимо отметить, что стоимость данного гемоцитокина достаточно высока, что ограничивает его широкое клиническое применение [2, 3].

Перспективным является поиск средств, обладающих гемостимулирующими свойствами, среди веществ растительного происхождения, не обладающих токсичностью и характеризующихся широким спектром фармакологических эффектов. Ранее показано, что полисахариды мать-и-мачехи

обыкновенной ( Tussilago farfara L .) способны уменьшать нейтропению при монохимиотерапии, при этом стимулирующий эффект полисахаридов на гранулоцитарный росток кроветворения был сравним с таковым у рекомбинантного гемоцитокина нейпогена [4].

Целью исследования явилось изучение влияния полисахаридов Tussilago farfara L . на эритроидный росток кроветворения, а также развитие опухоли и метастазов на фоне полихимиотерапии цисплатином и этопозидом.

Материал и методы

Эксперименты выполнены на мышах-самках линии С57BL/6 массой 19–20 г 1-й категории разводки лаборатории экспериментального биомоделирования Научно-исследовательский институт фармакологии и реабилитационной медицины им. Е.Д. Гольдберга, Томский НИМЦ (сертификат качества № 188-05). Содержание животных осуществляли в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей [5]. Исследование проведено по требованиям лабораторной практики (GLP), приказа МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики», Федерального закона «О лекарственных средствах» (статья 36), «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [6].

Рак легкого-67 перевивали животным внутримышечно по 5–6 млн опухолевых клеток в 0,1 мл физраствора и моделировали цитостатическую миелодепрессию путем введения комбинации противоопухолевых препаратов. Этопозид – ТЕВА (ТЕВА, Израиль) в дозе 5 мг/кг и цисплатин – ТЕВА (ТЕВА, Израиль) в дозе 2,5 мг/кг вводили мышам внутрибрюшинно, трехкратно на 10, 12 и 14-е сут после перевивки опухоли, интервал между введениями каждого препарата составлял 10–20 мин.

Методы выделения и изучения химической структуры полисахаридов Tussilago farfara L. (ПМИМ) (моносахаридный состав, определение содержания уроновых кислот) разработаны на базе Центра внедрения технологий и лаборатории инновационных фармацевтических технологий при Сибирском государственном медицинском университете (г. Томск) [7, 8]. В качестве препарата сравнения использовался рекормон (Roche, Франция), который вводили в дозе 10 Ед/мышь в течение 5 дней, начиная с 10-х сут после трансплантации опухоли. ПМИМ мыши получали внутрибрюшинно, начиная с 7-х сут после перевивки опухоли, в дозе 20 мг/кг. Контрольным животным во всех сериях экспериментов в аналогичном режиме вводили эквивалентный объем физиологического раствора (0,2 мл). На 1-е сут после второго и третьего введения цитостатиков (13-е и 16-е сут после перевивки опухоли) забирали периферическую кровь из хвостовой вены, определяли ее показатели на автоматическом гематологическом анализаторе «Abacus» («Diatron», Австрия) в ветеринарном режиме. В эти же сроки производили подсчет миелограмм и определение ретикулоцитов в периферической крови животных по стандартной методике [9]. Эффективность лечения оценивали по противоопухолевому и антиметастатическому действию препаратов, определяя массу опухоли, процент торможения ее роста (ТРО), частоту метастазирования, количество и площадь метастазов в легких, индекс ингибирования метастазирования (ИИМ) [6]. По окончании эксперимента животных умерщвляли, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные Министерством здравоохранения РФ. Эвтаназия производилась методом краниоцервикальной дислокации.

Обработку результатов проводили с использованием непараметрических критериев Вилкоксо-на – Манна – Уитни и углового преобразования Фишера. Различия считали достоверными при р<0,05 [10].

Результаты

Введение комбинации противоопухолевых препаратов вызывало значительные изменения в системе крови животных. Признаки подавления костномозгового кроветворения отмечались как после двукратного, так и после трехкратного введения цитостатиков, что выражалось в значимом уменьшении общего количества миелокариоци-тов в 2,2 и 1,7 раза соответственно. Содержание эритрокариоцитов под влиянием цитостатиков также было достоверно сниженным на эти сроки наблюдения в 2,3 и в 3,2 раза по сравнению с контролем (табл. 1)

Картина периферической крови практически соответствовала изменениям в костном мозге. Количество ретикулоцитов оказалось многократно ниже на 1-е сут после второго и третьего введения цисплатина и этопозида относительно контроля. Достоверное снижение числа эритроцитов (в 1,4 раза), показателя гемоглобина (в 1,5 раза) и гематокрита (в 1,7 раза) зафиксировано на 1-е сут после трехкратного введения цитостатиков (табл. 2).

У мышей, получавших совместно с полихимиотерапией ПМИМ, отмечено ускорение процесса восстановления эритропоэза, подавленного в результате введения цитостатиков. Так, количество эритрокариоцитов в костном мозге животных, леченных дополнительно полисахаридами, было достоверно выше такового в группе мышей, получавших только комбинацию антибластомных средств, на 1-е сут после их двукратного (в 1,6 раза) и трехкратного (в 1,8 раза) введения. Отмечено значимое увеличение общего количества миелокариоцитов в эти же сроки наблюдения (в 1,6 и 1,3 раза соответственно) по сравнению с таковыми у мышей, получавших противоопухолевые препараты изолированно (табл. 1).

Изменениям, происходящим в костном мозге мышей, леченных дополнительно полисахаридами, соответствовала динамика содержания клеток в периферической крови: количество ретикулоцитов было значимо выше такового у животных, получавших только полихимиотерапию. Кроме того, в этой группе наблюдения имело место более высокое содержание в крови зрелых эритроцитов (в 1,5 раза, р<0,05), показателей гемоглобина (в 1,2 раза, р<0,05) и гематокрита (в 1,3 раза, р<0,05) на 1-е сут после трехкратного введения комбинации цитостатиков (табл. 2).

При сравнительной оценке эффективности корректорных свойств ПМИМ и рекормона в условиях полихимиотерапии установлено: на 1-е сут после двукратного введения цитостатиков количество эритрокариоцитов у мышей, леченных рекормоном, превышало таковое в группе животных, получавших ПМИМ, однако после трехкратного введения различий между значениями эритрокариоцитов не наблюдалось (табл. 1). В периферической крови животных количество ретикулоцитов на 1-е сут после двукратного введения противоопухолевых препаратов в группе животных, получавших рекор-мон, не отличалось от такового у мышей, леченных

ПМИМ, при этом выявлено увеличение этого показателя на 1-е сут после трехкратного применения схемы «цисплатин + этопозид». Такие показатели, как количество эритроцитов, гемоглобин, гематокрит, в сравниваемых группах не отличались в оба срока наблюдения (табл. 2). Таким образом, полисахариды Tussilago farfara L. и известный препарат на основе рекомбинантного эритропоэтина – рекормон стимулируют процессы регенерации костномозгового эритропоэза у мышей при воздействии полихимиотерапией цисплатином и этопозидом. Следует отметить, что интенсивность восстановления при использовании этих двух препаратов несколько различается. Причиной этого может выступать избирательная чувствительность процессов пролиферации и дифференцировки системы эритропоэза к лекарственным средствам.

На 1-е сут после двукратного введения мышам цисплатина и этопозида (13-е сут после трансплантации рака легкого-67) не отмечено влияния цитостатиков на массу основной опухоли и частоту метастазирования, при этом количество и площадь метастазов в легких оказались достоверно ниже контрольных значений (в 3,2 и 3,0 раза соответственно). Если применение противоопухолевых препаратов на этот срок наблюдения не влияло на массу опухолевого узла, то добавление ПМИМ в схему цитостатического лечения приводило к достоверному уменьшению этого показателя таблица 1

Изменение показателей миелограмм у мышей линии С57вl/6 с раком легкого-67 под влиянием полисахаридов Tussilago farfara L. и рекормона на фоне терапии цисплатином и этопозидом, 10⁶/бедро

			Показатели миелограммы
Группа наблюдения, количество введений	Общая кле-точность	Незрелые нейтрофильные гранулоциты	Зрелые нейтрофильные гранулоциты	Эозинофильные гранулоциты	Эритрока-риоциты	Лимфоидные клетки	Моноциты

1-е сут после двукратного введения цитостатиков

1. Контроль	14,82 ± 0,5	2,41 ± 0,24	4,32 ± 0,13	0,12 ± 0,05	2,64 ± 0,14	5,06 ± 0,24	0,27 ± 0,07
2. Цисплатин × 2 + этопо-	6,83 ± 0,72	0,58 ± 0,09	1,27 ± 0,12	0,09 ± 0,03	1,16 ± 0,1	3,46 ± 0,49	0,28 ± 0,04
зид × 2	1-2р<0,05	1-2р<0,05	1-2р<0,01		1-2р<0,05	1-2р<0,01
3. Цисплатин х 2 + этопо-	10,81 ± 0,94	2,66 ± 0,3	3,46 ± 0,42	0,16 ± 0,08	1,81 ± 0,14	2,47 ± 0,25	0,26 ± 0,07
зид × 2 + ПМИМ × 7	2-3р<0,05	2-3р<0,01	2-3р<0,01		2-3р<0,05
4. Цисплатин × 2 + этопо-	9,58 ± 1,08	0,96 ± 0,18	2,16 ± 0,17	0,04 ± 0,02	3,00 ± 0,43	3,18 ± 0,54	0,24 ± 0,06
зид × 2 + рекормон × 3					2-4р<0,01

1-е сут после трехкратного введения цитостатиков

1. Контроль                17,51 ± 1,00	2,37 ± 0,15	4,13 ± 0,20	0,23 ± 0,10	2,44 ± 0,33	7,88 ± 0,67	0,46 ± 0,09
2. Цисплатин × 3 + этопо- 10,21 ± 0,62	0,8 ± 0,18	1,75 ± 0,36	0,07 ± 0,03	0,77 ± 0,09	6,46 ± 0,75	0,37 ± 0,05
зид × 3                      1-2р<0,01 3. Цисплатин × 3 + этопо- 13,60 ± 0,93	1-2р<0,01 1,90 ± 0,13	1-2р<0,01 3,16 ± 0,24	0,12 ± 0,04	1-2р<0,01 1,38 ± 0,13	6,45 ± 0,56	0,60 ± 0,09
зид × 3 + ПМИМ × 9      2-3р<0,05	2-3р<0,05	2-3р<0,01		2-3р<0,01		2-3р<0,05
4. Цисплатин × 3 + этопо- 1160 ± 109 зид × 3 + рекормон × 5      ,,	0,93 ± 0,12	2,01 ± 0,18	0,08 ± 0,04	1,20 ± 0,07 2-4р<0,01	6,87 ± 0,77	0,51 ± 0,07

Примечание: Здесь и в табл. 2 кровь на анализ брали у 5 животных в группе.

по сравнению с контролем (в 1,4 раза), при этом зафиксировано значимое повышение антимета-статического эффекта химиотерапии в группе комбинированного лечения с использованием полисахаридов: частота метастазирования снизилась с 80 до 20 % (р<0,05), ИИМ составил 98 %. Введение рекормона на фоне химиотерапии не изменяло эффективности цитостатиков после их двукратного применения (табл. 3).

На 1-е сут после трехкратного введения комбинации противоопухолевых препаратов (16-е сут после перевивки опухоли) выявлено достоверное уменьшение массы основной опухоли, а также количества и площади метастазов (в 2,7 и в 5,2

таблица 2

влияние полисахаридов Tussilago farfara L. и рекормона на показатели периферической крови мышей линии С57вl/6 с раком легкого-67 в условиях полихимиотерапии

Группа наблюдения, количество введений Количество ретикулоцитов, Г/л Количество эритроцитов, 1012/л Гемоглобин, г/л Гематокрит, % 1-е сут после двукратного введения цитостатиков 1. Контроль 663,39 ± 113,22 6,40 ± 0,10 104,60 ± 1,50 27,46 ± 0,70 2. Цисплатин × 2 + это- 4,86 ± 2,22 4,98 ± 0,94 83,00 ± 14,70 19,64 ± 3,51 позид × 2 1-2р<0,01 3. Цисплатин ×2 + этопо- 25,11 ± 4,69 5,79 ± 0,40 96,20 ± 6,00 22,82 ± 1,43 зид × 2 + ПМИМ × 7 2-3р<0,01 4. Цисплатин × 2 + это- 16,27 ± 4,55 4,13 ± 0,41 68,00 ± 6,80 16,44 ± 1,57 позид × 2 + рекормон × 3 2-4р<0,05 1-е сут после трехкратного введения цитостатиков 1. Контроль 685,54 ± 74,21 6,54 ± 0,22 105,00 ± 8,20 26,22 ± 2,01 2. Цисплатин × 3 + это- 5,40 ± 2,32 4,66 ± 0,69 69,20 ± 6,30 15,45 ± 2,05 позид × 3 1-2р<0,05 1-2р<0,05 1-2р<0,01 1-3р<0,01 3. Цисплатин × 3 + это- 46,93 ± 13,57 6,76 ± 0,47 83,80 ± 5,70 20,70 ± 1,34 позид × 3 + ПМИМ × 9 2-3р<0,05 2-3р<0,05 2-3р<0,05 2-3р<0,05 4. Цисплатин × 3 + это- 95,75 ± 10,95 6,44 ± 0,19 90,80 ± 5,80 21,22 ± 2,00 позид × 3 + рекормон × 5 2-4р<0,01 2-4р<0,05 2-4р<0,05 2-4р<0,05 таблица 3

влияние полисахаридов Tussilago farfara L. и рекормона на развитие опухоли рак легкого-67 и метастазов у мышей в условиях полихимиотерапии

Группа наблюдения × число введений (количество животных) Масса опухоли, г ТРО, % Частота метастазирования, % Количество метастазов на 1 мышь Площадь метастазов на 1 мышь, мм2 ИИМ, % 1-е сут после двукратного введения цитостатиков 1. Контроль (5) 3,76 ± 0,22 100 2,60 ± 0,60 0,18 ± 0,04 2. Цисплатин × 2 + 3,34 ± 0,15 11 80 0,80 ± 0,20 0,06 ± 0,01 75 этопозид × 2 (5) 1-2p<0,01 1-2p<0,01 3. Цисплатин × 2 + 2,70 ± 0,22 28 20 0,20 ± 0,20 0,01 ± 0,01 98 этопозид × 2 + ПМИМ × 7 (5) 1-3р<0,01 2-3р<0,05 4. Цисплатин × 2 + этопозид × 2 + рекормон × 3 (5) 3,48 ± 0,25 7 80 1,00 ± 0,32 0,07 ± 0,02 69 1-е сут после трехкратного введения цитостатиков 1. Контроль (5) 5,14 ± 0,17 100 4,00 ± 0,55 1,19 ± 0,65 2. Цисплатин х 3 + это- 4,50 ± 0,23 12 83 1,50 ± 0,43 0,23 ± 0,14 69 позид × 3 (6) 1-2p<0,05 1-2p<0,01 1-2p<0,05 3. Цисплатин х 3 + это- 4,09 ± 0,14 20 17 0,17 ± 0,17 0,01 ± 0,01 99 позид × 3 + ПМИМ × 9 (6) 2-3p<0,05 2-3p<0,01 2-3p<0,05 2-3p<0,01 4. Цисплатин × 3 + 60 этопозид × 3 + рекормон × 5 (5) 4,40 ± 0,15 14 1-4p<0,01 1,40 ± 0,68 0,98 ± 0,05 79 раза) по сравнению с нелеченым контролем. Совместное применение антибластомных средств и ПМИМ приводило к значимому уменьшению массы опухоли и показателей процесса диссеми-нации: количества метастазов (в 8,8 раза), площади метастатического поражения легких и частоты метастазирования (с 83 до 17 %) относительно этих значений в группе животных, получавших только полихимиотерапию, индекс ингибирования метастазирования при этом составил 99 % против 69 %. В отличие от полисахаридов Tussilago farfara L. рекормон при его добавлении в схему полихимиотерапии не изменял противоопухолевой и антиметастатической эффективности цитостатиков в эти сроки наблюдения. В то же время следует отметить тот факт, что случаев метастатического поражения легких в этой группе было меньше, чем в контроле, тогда как после трехкратного введения цисплатина и этопозида частота метастазирования не изменялась (табл. 3). Таким образом, добавление полисахаридов Tussilago farfara L. в схему полихимиотерапии повышает эффективность полихимиотерапии цисплатином и этопозидом.

Обсуждение

Костный мозг является одним из важнейших органов кроветворной системы, осуществляющим гемопоэз. Кроветворная ткань костного мозга содержит большое количество незрелых, недифференцированных и низкодифференцированных клеток, которые получили название стволовых. По мере созревания стволовые клетки дифференцируются в мультипатентные, которые являются клетками – родоначальниками различных ростков кроветворения, в том числе и эритроидного. Благодаря своей высокой пролиферативной активности клетки костного мозга обладают высокой чувствительностью к действию цитостатических агентов, что вызывает миелодепрессию и, как следствие, уменьшение количества клеток в периферической крови [11]. Миелодепрессия, сопровождающая химиотерапию, является пагубным фактором в достижении максимального противоопухолевого эффекта цитостатиков. В связи с этим поиск лекарственных средств, обладающих миелопротек-торными и/или гемостимулирующими свойствами, при этом не стимулирующих развитие опухолевого процесса, является чрезвычайно актуальным.

Анализ мазков костного мозга показал, что на 1-е сут после двукратного введения цитостатиков наблюдался защитный эффект полисахаридов Tussilago farfara L. в отношении эритрокариоцитов. Кроме того, увеличенное количество миелока-риоцитов в группе животных, леченных полисахаридами, наблюдалось и за счет повышенного содержания зрелых и незрелых нейтрофильных гранулоцитов. Изменения, происходящие в костном мозге, проявлялись в увеличении количества ретикулоцитов периферической крови и не затрагивали количество эритроцитов, показатели гемоглобина и гематокрита. Гемостимулирующий эффект полисахаридов в полной мере проявлялся на 1-е сут после трехкратного введения противоопухолевых препаратов: картина костного мозга была аналогичной, однако гемостимулирующее действие ПМИМ уже сказывалось на всех показателях периферической крови, что выражалось в увеличенном количестве ретикулоцитов, эритроцитов, показателей гемоглобина и гематокрита.

Механизм выявленного гемостимулирующего действия ПМИМ может быть обусловлен активацией процессов пролиферации и дифференцировки эритроидных прекурсоров в костном мозге животных, что приводит к увеличению количества эритрокариоцитов, а также выходу зрелых клеток в периферическую кровь, количественному увеличению эритроцитов, ретикулоцитов и показателей гемоглобина и гематокрита. Известно, что большинство растительных полисахаридов способно стимулировать функциональную активность макрофагов [12]. Связываясь со специфическими рецепторами макрофагов, полисахариды способны активировать эти клетки, что приводит к выработке ими различных цитокинов, в том числе ответственных за пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников. Изучение механизмов эритропоэзиндуцирующего действия ПМИМ представляет большой интерес и может явиться основой для создания препарата, защищающего эритроидный росток кроветворения от цитостатического повреждения.

Заключение

Добавление в схему полихимиотерапии цисплатином и этопозидом полисахаридов Tussilago farfara L. приводит к снижению миелосупрессии в отношении эритроидного ростка кроветворения и, как следствие, уменьшению анемии и рети-кулоцитопении в периферической крови. Гемопоэзиндуцирующее воздействие полисахаридов проявляется в полной мере на 1-е сут после трехкратного введения противоопухолевых препаратов и сравнимо с таковым у известного стимулятора эритропоэза – рекормона. Совместное применение полисахаридов Tussilago farfara L. и комбинации цитостатических препаратов повышает противоопухолевый и антиметастатический эффект полихимиотерапии, в то время как добавление рекормона в схему цитостатического лечения не изменяет его эффективности.