Протекторное действие биологически активных веществ на жизнеспособность эпидермальных клеток Allium cepa L. при кратковременном металлическом стрессе

В связи с проблемой загрязнения окружающей среды продуктами техногенеза тяжелые металлы (ТМ) стали объектом пристального внимания экологического мониторинга [2; 6]. Как и многие факторы среды, ТМ действуют на организм дозировано – их действие определяется не только концентрацией ионов, поступивших в клетку, но и продолжительностью экспозиции [2; 5; 13; 17]. Однако до сих пор чрезвычайно мало сведений о том, насколько быстро в клетках может развиться окислительный стресс и последующие за ним окислительные повреждения мембран и органелл. К тому же, в естественных условиях ТМ на своем пути минуют многочисленные барьеры, препятствующие их продвижению по растению [13].

В современной агрономической практике используется большое количество искусственных и натуральных биологически активных веществ (БАВ), способных защитить растения от холода, жары, засухи и других неблагоприятных факторов, повысить количество и качество урожая [1; 7; 8; 13–16; 19; 20]. Цель нашей работы – изучить влияние природных и синтетических БАВ на жизнеспособность растительных клеток на фоне непосредственного (на тканевом уровне) действия ТМ.

Постановка эксперимента. Клетки эпидермальной ткани луковицы лука ( Allium cepa L.) сорта «Каба» помещали в чашки Петри на растворы, содержащие 1 мМ или 10 мМ ионов ТМ (Cu²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺ или Co²⁺). Контролем была дистиллированная вода. Половина чашек Петри из каждого варианта опыта содержала тот или иной синтетический или природный регулятор роста (РР): 10 нМ тидиазурона (TDZ); 0,1 мкМ цитодефа (CTD); 25 ppm 6-бензиламинопурина (6-БАП); 0,1% гумат+7 (HUM) или иммуноцитофита (ICP – 10 мкМ этилового эфира арахидоновой кислоты). По истечении 2 ч. эпидермальную ткань лука погружали в гипертоничный раствор NaCl и через световой микроскоп Биолам ЛОМО С1 (увеличение 150), по наличию или отсутствию плазмолиза, подсчитывали количество живых и погибших клеток в 4–5 полях зрения в каждом варианте опыта. Опыт повторяли трижды. Результаты обрабатывали статистически по общепринятым биометрическим формулам. Значения в таблицах и на рисунке представлены в виде «среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего арифметического».

Из полученных в ходе экспериментов данных следует, что количество живых клеток в контроле на протяжении опыта оставалось на уровне около 85%. Ионы ТМ по-разному влияли на жизнеспособность эпидермальных клеток. Количество живых клеток в растворах, содержащих 1 мМ ионов Ni2+, Co2+ и Zn2+ после двухчасовой экспозиции оставалось на уровне контроля, в то время как та же концентрация Cu2+ вызывала снижение числа жизнеспособных клеток на 13%. Имела место тенденция к уменьшению количества живых клеток с увеличением концентрации ТМ. Однако в среде, содержащей ионы Cu2+ и Ni2+, наблюдали резкое существенное снижение жизнеспособности клеток. Как показали полученные результаты, Co и Zn лучше других металлов поддерживали жизнедеятельность растительных клеток, в то время как спустя 2 ч. экспозиции растворы, содержащие ионы Ni и Cu убивали от 5–12 до 11–30% клеток эпидермальной ткани лука (по сравнению с водным контролем).

Согласно методике, предложенной М. Н. Прозиной [4], если количество жизнеспособных клеток в той или иной токсичной среде меньше контрольной на 20% и более, то эта доза токсиканта считается летальной. Соответственно, если процент живых клеток в среде выше или на уровне контроля, то данная доза поддерживает жизнеспособность клеток и может считаться витальной (оптимальной). Сублетальные дозы, снижающие жизнеспособность клеток, лежат между этими экологическими зонами.

Можно заключить, что при кратковременном воздействии ионов Zn2+ и Co летальная зона находилась вне исследованных концентраций. Сублетальными были обе исследованные концентрации Ni2+. Летальным для клеток лука оказалось 2 ч. действие 10 мМ ионов Cu2+.

Из таблицы видно, что синтетические и природные регуляторы роста оказывали неодинаковое влияние на жизнеспособность клеток по сравнению водным контролем. Так, в среде, содержащей синтетические регуляторы роста тидиазурон и цитодеф, количество живых клеток достоверно снижалось относительно водного контроля на 6% и 9% соответственно. Природные регуляторы роста сами по себе не влияли на жизнеспособность эпидермальных клеток. Однако, на фоне ТМ, положительный эффект синтетических регуляторов роста был более заметен по сравнению с таковым у природных. Так, в растворах, содержащих 1 мМ ионов ТМ, синтетические регуляторы роста поддерживали жизнеспособность клеток лука в оптимальной и субоптимальной зонах в 92% случаев, против 75% – у природных регуляторов. При увеличении концентрации до 10 мМ эффективность синтетических и природных регуляторов роста значительно падала (они поддерживали количество живых клеток на уровне водного контроля в 42% и 38% соответственно).

Таблица

Жизнеспособность эпителиальных клеток луковицы Allium cepa L. при действии тяжелых металлов и регуляторов роста растений, % к водному контролю

Вариант опыта		Без РР	Регуляторы роста растений
			синтетические			природные
			CTD	TDZ	6-БАП	HUM	ICP
Вода		100 ± 0,7	81,3 ± 6,7	93,7 ± 1,4	100,3 ± 1,7	99,6 ± 1,7	97,9 ± 2
Co	1 мМ	98,7 ± 1,2	109,8 ± 1,5	99,5 ± 2,6	104,2 ± 7,4	107 ± 1,4	97,6 ± 1,7
	10 мМ	96,9 ± 1,4	107,9 ± 1,2	95,9 ± 2,9	94,6 ± 6,9	103,6 ± 2,8	97,2 ± 2,5
Zn	1 мМ	100 ± 0,9	94,6 ± 3,2	100 ± 4,9	99,9 ± 2	99,1 ± 2,4	91,3 ± 1,1
	10 мМ	96,5 ± 0,9	94,5 ± 2,2	103,5 ± 5,5	101 ± 3	98,6 ± 1,5	89,2 ± 2,2
Ni	1 мМ	94 ± 1,1	96,5 ± 4,6	100,1 ± 4,2	99,5 ± 2	92,2 ± 0,8	101,5 ± 2,4
	10 мМ	85,8 ± 1,9	94,2 ± 3,1	94,6 ± 3,1	100,4 ± 2,9	87,8 ± 5,3	82,4 ± 4,6
Cu	1 мМ	85,4 ± 8,6	92,1 ± 1,3	106,3 ± 2,5	100 ± 1,8	102,5 ± 2,7	97,4 ± 1,8
	10 мМ	64,2 ± 8,1	24,8 ± 1,6	23,3 ± 1,6	49,2 ± 3,5	88,6 ± 2,4	78,8 ± 2,4

― летальная зона

― витальная (оптимальная) зона

― субоптимальная зона

― сублетальная (пессимальная) зона

Кроме того, можно оценить относительную эффективность регуляторов роста, сравнивая жизнеспособность эпидермальных клеток в обработанных и необработанных РР вариантах. Можно констатировать, что реакция клеток на регуляторы роста металлоспецифична. Так, на фоне 1 мМ исследованных ТМ наиболее эффективны следующие регуляторы роста: на фоне Ni – иммуноцитофит и тидиазурон, на фоне Co – цитодеф и гумат+7, на фоне Cu – тидиазурон и гумат, на фоне Zn – ни один из исследованных РР существенно не повышал жизнеспособности клеток (рисунок 1, А). При увеличении концентрации ТМ до 10 мМ наибольший эффект оказывали: при повышенном содержании Ni – 6-БАП, Co – цитодеф и гумат+7, Cu – гумат+7 и иммуноцитофит, Zn – тидиазурон (рисунок 1, Б).

Варианты обработки

Варианты обработки

\© и 130

о ft а м 120

Ию f >»

Я я 110

Й и 100

о Г ч 90

■ CTD    HTDZ 16-БАП BHUM И1СР

Рис. 1. Сравнительная эффективность регуляторов роста на фоне А – 1 мМ и Б – 10 мМ ТМ.

Таким образом, при кратковременном сильном Zn-стрессе тидиазурон оказывал слабый протекторный эффект на клетки лука. В присутствии ионов Co2+ слабоэффетивны: тидиазурон, 6-БАП и иммуноцитофит; на фоне ионов Cu2+ – синтетические РР, а на фоне ионов Ni2+ – природные РР.

Мы предполагаем, что в условиях проведенного эксперимента в вариантах без РР наблюдались прямые последствия развития окислительного стресса [3; 5; 9; 11; 12; 17; 18], который уже в течение нескольких часов убивал значительное число эпидермальных клеток. В ряде вариантов с РР, очевидно, уже успевали активироваться механизмы устойчивости [7; 8; 10; 13–16; 19; 20], ущерб от окислительных повреждений был частично или полностью нивелирован. Однако влияние высоких (10 мМ) концентраций металлов все же приводило к летальным уровням АФК и гибели клеток.

Выводы.

• 1.    Токсичность всех изученных ТМ возрастала с повышением их концентраций, однако этот эффект проявлялся в большей степени на фоне ионов Ni²⁺ и Cu²⁺.

• 2.    Спустя 2 ч. экспозиции эпидермальных клеток на растворах, содержащих регуляторы роста, успевали включаться протекторные механизмы, которые в ряде случаев частично или полностью нивелировали возникающие под действием ионов металлов окислительные повреждения.

• 3.    Степень эффективности регуляторов роста металлоспецифична. При сильном загрязнении среды металлами наибольший эффект оказывали: при повышенном содержании Zn – тидиазурон, Co – цитодеф и гумат+7, Ni – синтетические препараты цитокининового типа действия, Cu – природные регуляторы роста.