Протеолитическая активность бактерий соленых озер пустыни Бадаин Жаран (Внутрення Монголия, Китай)

Соленые озера пустыни Бадаин Жаран являются экстремальными экосистемами и характеризуются высокими значениями солености до 495 г/л и рН до 10,63. Микроорганизмы, обитающие в этих экосистемах, представляют значительный интерес как для фундаментальных исследований, так и для потенциальных практических применений. Протеолитические бактерии являются первичными деструкторами органического вещества в экосистемах. Большинство протеолитиков используют в качестве источника углерода и энергии пептидов благодаря наличию внеклеточных пептидаз, активных в широких диапазонах значений рН и солености [1, 2].

Исследования выделения, идентификации и классификации ферментов протеолитической активности в последние годы проводятся особенно интенсивно, что объясняется востребованностью и многообразием протеолитических ферментов [2].

Цель работы – изучить количественный состав протеолитических бактерий и их активность в нативных образцах.

Объекты и методы

Объектами исследования являются соленые озера пустыни Бадаин Жаран, которые расположены в югоцентральной части автономного района Внутренняя Монголия, а также северной части провинции Ганьсу, расположенные на высоте около 1200 м над уровнем моря в Альхо Плато на территории пустыни Гоби. Озера встречаются в основном в южном регионе провинции пустыни Бадаин Жаран. Для исследования были отобраны пробы микробных матов, донных осадков, ила, соли, песчаного осадка в августе 2013 г. Места отбора проб характеризуются высокой концентрацией хлорида натрия (6-495 г/л) и значениями рН ( 8,99-9,87).

Е.Б. Эрдынеева, Е.В. Лаврентьева, А.А. Раднагуруева. Протеолитическая активность бактерий соленых озер пустыни Бадаин Жаран (Внутрення Монголия, Китай)

Методы исследования

В местах отбора проб определяли рН среды потенциометрически при помощи полевого рН-метра рНер (Португалия). Значение общей минерализации определяли портативным тестер-кондуктометром TDS-4.

Учет численности и выделения аэробных галофильных протеолитических бактерий проводили методом предельных разведений на модифицированной среде Пфеннига следующего состава (г/л): NH 4 Cl – 0,5; KH 2 PO 4 – 0,5; MgCl 2 – 0,5; СаСl 2 – 0,05; дрожжевой экстракт – 5. В качестве субстрата для протеолитиков вносили пептон 5 г/л, а для учета численности вносили 250 г/л хлорид натрия. рН²⁵ С среды доводили бикарбонатно-карбонатным буфером до 8,5–9,5, температура инкубации 30^оС [3].

Морфологию, размеры, подвижность клеток изучали микроскопированием образцов с помощью светового микроскопа AxioStar Plus (Karl Zeiss) в фазовом контрасте. Готовились препараты живых и фиксированных окрашенных клеток. В качестве источника секретируемых пептидаз использовали белковый экстракт из нативных проб. Белковый экстракт получали путем перетирания 1 см2 микробного мата или донных осадков с добавлением 1 мл фосфатного буфера рН 7 в ступке. Биомассу отделяли от нее методом центрифугирования (20 тыс. g в течение 25-30 мин). В пробы добавляли 0,0025% азида натрия, препятствующего развитию микроорганизмов. Хранение осуществляли при 4оС. Внеклеточную протеазную активность определяли по методу Эрлангера [4], используя синтетические n-нитроанилидные субстраты (спектрофотометр CECIL 1021). N-нитроанилидные субстраты содержат аналог пептидной связи, которая расщепляется под действием пептидазных ферментов. В результате расщепления выделяется n-нитроанилин, окрашивающий реакционную смесь в желтый цвет. Все n-нитроанилидные субстраты растворяли в диметилформамиде. Растворы GlpFApNA, GlpFpNA и BAPA готовили с концентрацией 0,02 М; GlpAALpNA и субстраты для аминопептидаз – 0,1 М. Для определения пептидазной активности смешивали 700 мкл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,0), 10 мкл раствора субстрата и 50 мкл пробы. Проводили измерение поглощения в нулевой момент, после реакционную смесь инкубировали в термостате при 37оС в течение 1 ч. Интенсивность окраски определяли спектрофотометрически при длине волны 410 нм [5].

Результаты и исследования

Были изучены образцы проб (микробные маты, донные осадки, ил, соли, песчаные осадки) соленых озер пустыни Бадаин Жаран, где значения рН и солености варьировались. Наибольшие концентрации хлорида натрия обнаружены в точках Bj-02, Bj-03A, Bj-05 (до 495 г/л) и наибольшие значения рН – в точках Bj-04, Bj-07 (до 9,87). Максимальная численность протеолитических бактерий достигала 10-6 кл/см3 в микробных матах (табл. 1). Численность протеолитиков в изучаемых озерах колеблется от 1 до 6 млн кл/см3. Максимальные значения обнаружены в микробных матах точек Bj-03A, Bj-04, Bj-07, Bj-08, Bj-09, а минимальное значение – в песчаном мате точки Bj-11.

Внеклеточная протеолитическая активность в нативных пробах. Все образцы проб показали активность на субтилизинподобных, трипсинподобных, химотрипсиноподобных, цистеиновых и аминопептидазных субстратах (рис. 1). Максимальная пептидазная активность в нативных образцах по субстрату, Phe-pNa была зафиксирована в точке Bj-07, которая составляет 2,728 ед.

Таблица 1 Физико-химическая характеристика проб и численность протеолитических бактерий в илах и микробных матах

Рис. 1. Внеклеточная протеолитическая активность

В целом отмечено, что наибольшая внеклеточная протеолитическая активность по всем субстратам обнаружена в песчаном мате точки Bj-02 и микробных матах точек Bj-07 и Bj-08.

Впервые проведенные исследования распространения и количественной оценки протеолитических бактерий в озерах пустыни Бадаин Жаран показали, что протеолитические бактерии являются активным компонентом микробного сообщества в этих экстремальных условиях