Протеолитическая активность яда обыкновенных гадюк из некоторых популяций России и Украины

Исследование внутривидовой изменчивости свойств змеиных ядов имеет теоретическое значение в плане установления причин и пределов вариабельности биохимических параметров ядовитого секрета. Изменчивость свойств ядов необходимо учитывать при производстве эффективных антисывороток и лекарственных препаратов на основе змеиных ядов.

Обыкновенная гадюка Vipera berus на территории России и Украины представлена, согласно принятой нами точке зрения, двумя подвидами – номинативным V. b. berus и лесостепным, или гадюкой Никольского, V. b. nikolskii . В европейской части Российской Федерации и в Украине известны популяции, совмещающие признаки обоих подвидов [1, 2, 4, 9–11, 13].

Протеолитическая активность (ПА) яда обыкновенных гадюк, населяющих речной бассейн Волги, уже затрагивалась в наших ранее вышедших публикациях [3, 5–8]. Задачей настоящей работы является сравнительный анализ ПА яда обыкновенных гадюк из различных популяций в пределах ареалов номинативного и лесостепного подвидов на территории России и Украины.

Материалы и методы

Образцы яда от отловленных обыкновенных гадюк получали в лаборатории экологической токсикологии Института экологии Волжского бассейна РАН. Змей «доили» механическим способом в чашки Петри (диаметром 40 мм с низким бортиком). Ядовитый секрет сушили в стандартных условиях в эксикаторе над хлористым кальцием не менее 12 суток. Затем кристаллический яд собирали и анализировали. В некоторых случаях образцы яда были собраны и переданы для анализа нашими коллегами. Каждый образец представлял собой секрет ядовитых желез, собранный от одного или нескольких (до 10) экземпляров гадюк (разновозрастных и разнополых, но из одной популяции).

Определение ПА в образцах проводили, используя в качестве субстрата казеин [14]. Навеску сухого яда (0,6–0,8 мг) растворяли в физиологическом растворе и инкубировали 15–20 мин. при 37°С для полного растворения яда. Реакционная смесь состояла из 1 мл раствора яда и 1 мл 2% -го казеина в 0,4 М Тris-HCL буфере (рН = 8,2). Реакцию запускали добавлением субстрата и проводили 30 мин. при 37°С. Затем добавляли двойной объем 5%-ой охлажденной трихлоруксусной кислоты (ТХУ), инкубировали 20–30 мин.

при комнатной температуре до полного формирования осадка и фильтровали. В фильтрате определяли количество гидролизованного субстрата, не осаждаемого ТХУ, по тирозину, окрашиваемому 0,5 N реактивом Фолина, колориметрически по поглощению при 670 нм. Удельную активность протеолитической (казеинолитической) активности рассчитывали как количество образовавшегося тирозина в мкг за 1 мин. в расчете на 1 мг белка (мкг тирозина/мг белка • мин.). Определение концентрации белка проводили по методу Лоури [12].

Статистический анализ результатов проводили общепринятыми методами. За объем выборки n принимали общее число определений ПА одного образца или нескольких образцов из определенного географического пункта. При вычислении средней арифметической M и ее ошибки m всем вариантам в выборочной совокупности n придавали равный «вес».

Результаты и обсуждение

Результаты экспериментального определения ПА в образцах ядовитого секрета обыкновенных гадюк приведены в табл. 1. Как видно из таблицы, минимальное среднее значение ПА (2,6 мкг тирозина/мг белка • мин.) отмечено для образца из Змиевского района Харьковской области, которое на порядок ниже максимального среднего значения ПА (28,0), отмеченного для образца из Майнского района Ульяновской области. Важно подчеркнуть, что, судя по имеющимся данным о распространении подвидов обыкновенной гадюки [13], первый образец взят из ареала V. b. nikolskii , а второй – из зоны интерградации данного подвида с V. b. berus, либо из ареала V. b. berus . Яд гадюк, отловленных в Нижегородской области, которая отнесена к ареалу V. b. berus , также имеет высокие значения ПА (20,6). В целом же можно отметить, что наиболее «чистые» популяции гадюки Никольского имеют низкую ПА яда, а наиболее удаленные от них популяции номинативного подвида имеют высокую ПА.

Растянутый переход от минимальных значений ПА к максимальным свидетельствует в пользу наличия широкой зоны интрогрессии, предположение о существовании которой было высказано после морфологического анализа [13, 15]. Переход от низких к высоким значениям ПА в общем происходит при продвижении с юга на север, но есть ряд исключений. К ним относится, к примеру, Тон-шаевский район Нижегородской области и Майнский район Ульяновской области: первый находится севернее, но среднее значение ПА ниже.

По-видимому, значительная вариабельность ПА в яде обыкновенных гадюк из разных популяций обусловлена многими причинами – генетической вариабельностью признаков, историческими причинами, различиями в условиях местообитаний змей и т.д. Существенные различия в ПА образцов из близко расположенных географических пунктов могут быть связаны с труднопреодолимыми для гадюк преградами. Так, Самарская область находится в пределах контактной зоны подвидов V. b. berus и V. b. nikolskii [13]. Здесь в высшей степени статистически достоверные различия (0,1%-ый уровень значимости) ПА яда выявлены у гадюк из г. Самара (20,2 мкг тирозина/мг белка • мин.) и национального парка «Самарская Лука» (14,3). Расстояние по прямой между местами отлова в Самаре и национальном парке составляет менее 100 км. Однако названные пункты разделены широкой рекой так, что первый пункт находится на левом берегу Волги, а второй – на правом.

Любопытно, что ПА ядовитого секрета гадюк двух образцов разного цвета (желтого и бесцветного) в пределах одной популяции могут достоверно различаться. Нами установлено, что отдельно собранные в Кондольс-ком районе Пензенской области России образцы яда, отличающиеся по цвету, имеют и статистически достоверные различия средних значений ПА: по сравнению с бесцветным ядом у желтого уровень ПА выше (табл. 2). Считается [13], что для номинативного подвида обыкновенной гадюки характерен желтый яд, а для гадюки Никольского – бесцветный. Популяция из Кондольского района Пензенской области, находящаяся на гра-

Таблица 1. Значение протеолитической активности (ПА) яда обыкновенных гадюк из разных популяций России и Украины

Регион	Район отлова	n	ПА, мкг тирозина/мг белка • мин.
			lim	M ± m
Самарская обл.*	г. Самара	15	14,6–26,1	20,2±0,85
	Ставропольский р-н, НП «Самарская Лука»	8	13,1–17,7	14,3±0,55
Нижегородская обл.*	Тоншаевский р-н	8	19,2–22,3	20,6±0,41
Ульяновская обл.*	Майнский р-н	5	24,2–31,3	28,0±1,33
Пермская обл.*	Кунгурский р-н	4	17,1–18,5	17,7±0,31
Республика Татарстан*	Лаишевский р-н	9	12,0–22,5	16,5±1,12
	Лениногорский р-н	5	14,8–21,2	18,3±1,16
	Зеленодольский р-н	4	21,9–27,7	23,7±1,35
	Азнакаевский р-н	5	13,6–19,8	17,3±1,10
Республика Мордовия*	Ковылкинский р-н	9	14,4–18,9	16,7±0,47
	Кочкуровский р-н	4	16,4–20,1	17,9±0,84
	Большеигнатовский р-н, НП «Смольный»	9	6,7–19,7	13,3±1,54
	Темниковский р-н	5	14,5–23,9	18,0±1,66
Республика Чувашия*	Алатырьский р-н	5	19,7–23,9	22,4±0,78
Киевская обл. **	Бориспольский р-н	3	12,4–14,7	13,3±0,74
Черниговская обл.**	Ичнянский р-н	3	12,5–13,8	13,2±0,39
Пензенская обл. *	Кондольский р-н	9	6,4–11,5	9,3±0,56
Пензенская и Саратовская обл.*	Долина р. Хопер на границе Бековского и Тамалинского р-нов Пензенской обл. с Ртищевским р-ном Саратовской обл.	5	6,0–9,4	8,2±0,59
Саратовская обл.*	Аткарский р-н	4	7,4–8,0	7,8±0,13
Кировоградская обл.**	Знаменский р-н	4	6,5–8,3	7,2±0,42
Харьковская обл.**	Змиевский р-н	3	2,1–3,0	2,6±0,49

Примечание: * – Россия; ** – Украина.

Таблица 2. Значения ПА в образцах яда гадюк из Кондольского района Пензенской области

Цвет яда n ПА, мкг тирозина/мг белка • мин. P lim M±m Желтый 5 9,4–11,5 10,5 ± 0,41 < 0,001 Бесцветный 4 6,4–8,8 7,8 ± 0,54 нице Волжского и Донского бассейнов, вероятно, относится к зоне интерградации двух подвидов. Данная популяция, по сравнению с другими популяциями из бассейна Волги, имеет более низкие средние значения ПА. Одна часть гадюк в этой популяции имеет яд желтого цвета, а другая – бесцветный.

Полученные нами данные о протеолитической активности подтверждают давно известный, но недостаточно освещенный в литературе факт отличия свойств яда номинативного и лесостепного подвидов обыкно- венной гадюки. Приведенные материалы позволяют предположить, что подвид V. b. nikolskii имеет в среднем более низкие значения ПА по сравнению с V. b. berus и гибридными популяциями. Низкий уровень ПА ядовитого секрета может использоваться для диагностики гадюки Никольского, которая имеет на территории России и Украины обширную зону интерградации с номинативным подвидом обыкновенной гадюки.

Важное значение для трактовки взаимоотношений V. b. berus и V. b. nikolskii представ- ляет собой связь морфологии обыкновенных гадюк со свойствами их яда. Этому вопросу мы планируем посвятить специальные исследования.