Пучково-плазменные технологии получения хитоолигосахаридов с фитостимулирующими свойствами

В настоящее время резко возросла, востребованность природного полимера. - хитина, и его деацетилированного производного хитозана. Это связано с широким распространением этих полимеров в природе и вознобновляемостью их сырьевых источников. Кроме того, эти биополимеры обладают уникальным комплексом свойств: низкой токсичностью, высокой комплексообразующей активностью, хорошей совместимостью с тканями организма, способностью к биодеградации и др. [1, 2, 3]. Среди областей, где применяются биополимеры, можно назвать биотехнологию, медицину, косметическую промышленность и сельское хозяйство.

Известно, что хитоолигосахариды, молекулярный вес которых не превышает 10 кДа, эффективно стимулируют рост и плодоношение растений, индуцируют их собственные биохимические механизмы защиты, повышая устойчивость к различными патогенным

«Московский физико-технический институт (научный исследовательский университет)», 2019

микроорганизмам, болезням и неблагоприятным факторам окружающей среды [4-6]. Перечисленные свойства делают низкомолекулярные хитозаны чрезвычайно перспективными агентами для разработки экологически чистых технологий возделывания сельскохозяйственных культур.

Целью работы была разработка метода получения хитоолигосахаридов с помощью электронно-пучковой плазмы (ЭПП) и подтверждение их фитостимулирующей активности.

2.    Принцип предлагаемого метода и экспериментальная установка

В настоящей работе для обработки хитозана использовалась ЭПП, которая генерируется при инжекции электронного пучка в плотные газообразные среды [7-9]. Получаемая ЭПП сильно неравновесна: в ее составе присутствуют молекулы, атомы, радикалы и ионы в основном и в возбужденном состояниях, а также электроны плазмы и электроны инжектируемого пучка. Концентрации тяжелых частиц плазмы существенно превышают их равновесные значения, что и определяет высокую химическую активность ЭПП. Экспериментально доказано, что температуру в процессе модификации материалов удается поддерживать на уровне 300-400 К без потери высокой химической активности ЭПП, что позволяет работать с термолабильными соединениями, в том числе и с полисахаридами. Деструкция хитозана проводилась в электронно-пучковом плазмохимическом реакторе, устройство и принцип действия которого представлены в [7]. Рис. 1а иллюстрирует процесс ЭПП-обработки порошков биополимеров. Сформированный в высоком вакууме (~ 105 Торр) электронный пучок (ЭП) (3) инжектировался в заполненную плазмообразующей средой реакционную камеру (6) через газодинамическое выводное окно (4), при этом формировалось облако химически активной ЭПП (7). ЭП сканировали в круглый растр с помощью электромагнитной системы (5), что повышало равномерность обработки материала (10). С целью увеличения массы обрабатываемого порошка были разработаны специальные дополнительные устройства, в реакционном объеме которых организовано перемешивание значительного количества порошка в процессе обработки. Барабан устанавливали в реакционной камере так, что его ось совпадала с осью инжекции ЭП. Расстояние от выводного окна до барабана выбирали так, чтобы облако ЭПП было локализовано преимущественно внутри барабана (рис. 16).

а)

б)

Рис. 1. Схема, плазмохимического реактора, (а) и процедура. ЭПП-стимулироваппой деструкции порошков полисахаридов (б): 1 - электронная пушка; 2 - высоковакуумная камера; 3 - электронный пучок; 4 - выводное устройство; 5 - электромагнитная отклоняющая система; б - рабочая камера; 7 - облако ЭПП; 8 - кварцевая труба; 9 - внутренние ребра; 10 - реакционная зона; 11 - порошок обрабатываемого полисахарида; 12 - регулируемый патекатель

В экспериментах в качестве плазмообразующего газа, использовался кислород при давлении 5-10 Торр. В качестве исходного сырья использовали порошок хитозана.

(Му = 500кДа) со степенью дезацетилирования 85% и полидисперсностью 2,5. Температура порошка хитозана в процессе ЭПП-обра.ботки измерялась оптическим пирометром Optris LS (Optris GmbH, Германия) и составляла 40 °C. Сила тока пучка lb подбиралась таким образом, чтобы поддерживать постоянным указанное значение температуры и варьировалась в пределах 1 < lb < 100 мА. Энергия электронов на входе в реакционную камеру была постоянной и составляла 30 кэВ. Время ЭПП-деструкции варьировали в пределах 2-10 мин.

3.    Результаты

В результате ЭПП-деструкции хитозана формировались низкомолекулярные хитооли-госахариды, молекулярная масса которых по данным гельпроникающей ВЭЖХ варьировалась в пределах 570-815 кДа. Таким образом, значения молекулярных масс продуктов деструкции соответствовали набору олигомеров хитозана от димера до гептамера. При этом формирование низкомолекулярных продуктов происходило в течение первых двух минут плазмохимического воздействия. Вероятно, что формирование хитоолигосахаридов связано с действием активных частиц плазмы (особенно активных форм кислорода) на /3 — 1,4 гликозидные связи природного биополимера. Возможный механизм деструкции приведен на рисунке 2.

Рис. 2. Схема, плазмохимической деструкции хитозана. [10]

Степень деацетилирования полученных хитоолигосахаридов определялась с помощью Ш ЯМР и составляла, около 93%. Вторым возможным сайтом радикального действия ОН является хитиновая N-ацетильная группа. Это преобразование было обнаружено как для производных аминокислот, таких как N-ацетилметионин [11], так и для гликозааминогли-канов (например, гиалуронан) [12, 13] под действием кислородсодержащих радикалов и некоторых других активных форм кислорода.

Механизм, представленный на. рис. 3, предполагает образование углерод-центрированных радикалов С-4 и последующую реакцию расщепления этих радикалов, приводящую к разрыву /3 — 1,4 гликозидных связей.

Биологические испытания выполняли на. модельном растении Arabidopsis thaliana, семена. которого в процессе культивирования обрабатывали 0,025% и 0,1% растворами ЭПП-полученных хитоолигосахаридов в дистиллированной воде. Исследованные растворы обладали фитостимулирующим действием и ускоряли развитие корневой системы растений: длина, корней Arabidopsis thaliana, обработанных 0,1% раствором хитоолигосахаридов, полученных при ЭПП-деструкции хитозана в течение 2 мин, увеличивалась на ~ 35% по сравнению с контрольной группой растений (рис. 4).

Рис. 3. Схема, деградации хитина, под действием гидроксильных радикалов в ЭПП: нападение радикалов ОН на группы хитин - NH 2

Рис. 4. Стимулирование роста, корневой системы растений 0,025% и 0,1% водными растворами хитоолигосахаридов, полученных с помощью ЭПП-деструкции хитозана, в течение 2 и 10 мин, * -результаты достоверны по отношению к контролю (р<0,05)

4.    Заключение

Экспериментально доказана возможность получения низкомолекулярных водорастворимых олигосахаридов в ЭПП кислорода газов. При этом наблюдается пороговый характер зависимости, связывающей степень деструкции полимера с длительностью пучковоплазменного воздействия, что позволяет оптимизировать процесс обработки и исключить непроизводительные энергозатраты. Показано, что низкомолекулярные водорастворимые продукты ЭПП-деструкции хитозана обладают свойствами стимуляторов роста растений.

Работа выполнена при поддержке Минобрнауки, проект № 10А.100.