Путь трансформации лактозы в этанол дрожжами Kluyveromyces lactis

На предприятиях, выпускающих творожную и сырную продукцию, ежедневно образуются тонны побочного продукта – сыворотки, содержащей большое количество лактозы. Значительная часть данного продукта утилизируется в окружающую среду, нанося ощутимый ущерб окружающей среде [1].

Трансформация лактозы в этанол помогает завершить цепочку переработки молока, принося дополнительную прибыль и частично решает проблему утилизации лактозосодержащего сырья [2]. В качестве катализаторов ферментации лактозы используют дрожжи Kluyveromyces lactis [3].

Цель исследования – анализ ферментативного пути трансформации лактозы в этанол дрожжами Kluyveromyces lactis.

Для проведения теоретического исследования биотрансформации лактозы в этанол дрожжевыми культурами K. lactis использовалась информация из открытых баз данных белков и ферментов (KEGGA, NCBI, SCOP, UniProt).

Для биотрансформации молочной сыворотки в этанол дрожжи Kluyveromyces lactis сначала осуществляют гидролиз лактозы в глюкозу и галактозу, затем метаболизируют глюкозу по окислительному пентозофосфатному пути. В результате ряда ферментативных превращений обра- зуется ацетил-фосфат, восстановление которого в два этапа приводит к появлению молекулы этилового спирта [4].

В начале пути выработки биоэтанола из молочной сыворотки происходит гидролиз дисахарида лактозы ферментом из семейства β-галактозидаз – лактазы. Лактаза представляет собой экзогликозидазу, которая гидролизует бета-1-4-гликозидную связь, образованную между молекулами галактозы и глюкозы. Является четвертичной структурой, свёрнутой по классической для ферметов семества GH2 схеме. Состоит из 1025 аминокислот, в последовательности которых определяется в 5 доменов.

В результате, из молекулы лактозы образуется по одной молекуле галактозы и глюкозы за счёт расщепления β-галактозидных связей. Далее, фермент гексокиназа катализирует фосфорилирование D-глюкозы с использованием энергии АТФ, результатом которой является образование глокозо-6-фосфата. Гексокиназа относится к классу трансфераз и обладает способностью переносить неорганическую фосфатную группу с АТФ на субстрат. Длина последовательности состоит из 475 аминокислот.

Далее происходит окисление глюкозо-6-фосфата с помощью фермента из группы оксидоредуктазы – глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. G6PD представляет собой цитозольный фермент – первый фермент, катализирующий реакцию пенто-зофосфатного гликолиза, восстановливая НАДФ до НАДФН. Состоит из 515 аминокислот и обычно находится в виде димера двух идентичных мономеров.

Затем происходит реакция гидролиза 6-фосфоглюконо-δ-лактона до 6- фосфоглюконата с помощью 6-фосфоглюконолактоназы посредством переноса протона на атом кислорода в кольце O5. 6PGL является цитозольным ферментом, относящемся к классу гидролазы. Третичная структура 6PGL состоит в виде α/β-гидролазной складки с остатками активного центра, сгруппированными на петлях α-спиралей. Состоит из 321 аминокислоты.

Следующим шагом в процессе является декарбоксилирующиее востановление 6-фосфоглюконата в рибулозо-5-фосфат в присутствии НАДФ ферментом 6- фосфоглюконатдегидрогеназа. 6PGD принадлежит к группе окислительных декарбоксилаз. Является гомодимером и содержит смешанный параллельный и антипа-раллельный 6-цепочечный бета-лист. 6PGD состоит из высококонсерватиной последовательности 492 аминокислот.

Следующий этап неокислительной фазы пентозофосфатного пути – это взаимное превращение между D-рибулозо-5-фосфатом и D-ксилулозой-5-фосфатом с помощью фермента фосфопентозэпимеразы, принадлежащей к семейству изомераз. Кроме того, в базе данных Structural

Classification of Proteins (SCOP) определено суперсемейство «связывания рибулозофосфата», членом которого является эта эпимераза. PPE существует в виде гомодимера, который сворачивается в бочкообразную структуру β/α. PPE состоит из 327 аминокислот.

Затем происходит активация фосфокетолазой реакции расщепления D-ксилулозо-5-фосфата на ацетил-фосфат. Фосфокетолаза может использовать 3 различных сахарофосфата в качестве субстратов и лишь один кофактор - дифосфат тиамина. Фермент имеет бочкообразную структуру TIM (α/β баррель).

Далее происходит двухэтапное восстановление ацетилфосфата до этилового спирта. С помощью фосфатацетилтранс-феразы ацетил-фосфат дефосфорилируется до уксусного альдегида. Фосфатацети-лтрансфераза принадлежащит к семейству ацилтрансфераз, передающим группы, отличные от аминоацильных групп. Пептидная последовательность из 714 аминокислот сворачивается в третичную структуру белка α+β.

Последним этапом происходит окисление ацетальдегида до этанола, катализируемое алкогольдегидрогеназой. ADH1 – фермент семейства оксидоредуктаз, катализирующих окисление первичных и вторичных спиртов до альдегидов и кетонов. ADH1 содержит цинк в своем каталитическом центре. Состоит из 350 аминокислот.

В таблице указана общая информация о протекающих в ходе процесса биотрансформации лактозы в этанол реакций.

Таблица. Процесс биотрансформации лактозы в этанол с указанием принимавших уча- стие веществ и ферментов

Описание структурной характеристики ферментов Kluyveromyces lactis, участвующих в биотрансформации лактозы в этанол позволит получить подробное пред- опорные данные для применения процесса в молочной промышленности с целью получения экономической выгоды и предотвращения ущерба окружающей среде.

ставление о данном процессе, и создать