QTL анализ биохимических признаков качества у brassica rapa l

Brassica rapa L. – представитель сложного и многогранного рода Brassica – включает не только важные сельскохозяйственные культуры, но и является уникальным модельным объектом для генетических и молекулярных исследований у высших растений. Его уникальность определяется тем, что в состав B. rapa входят масличные, овощные и кормовые культуры, играющие исключительную роль в мировой экономике и являющиеся источником ценных питательных и биологически активных веществ. Особенность химического состава культур рода Brassica – высокое содержание воды и низкое жиров – обусловливает низкую калорийность капустных растений. Они отличаются относительно высоким содержанием углеводов и белков, включающих девять незаменимых аминокислот.

Овощные растения рода – богатый источник минеральных элементов, прежде всего, калия и кальция, а также серы, фосфора, цинка, железа, марганца. Они выделяются высоким содержанием биологически активных веществ – ферментов, пигментов, витаминов, а также вторичных метаболитов, которые проявляют антиканцерогенное, антиоксидантное и противовоспалительное действие, стимулируют иммунную систему, препятствуют развитию сердечнососудистых болезней и расстройств, связанных с возрастом.

Изменчивость биохимического состава в пределах вида B. rapa очень велика (предшествующие исследования, а также см. Соловьева, Артемьева, 1999, 2004, 2005, 2006а,б, 2010). В последние годы установлены особенности накопления основных элементов биохимического состава и биологически активных веществ ранее мало изученными в ВИР восточноазиатскими капустными культурами вида B.rapa, в том числе отдельными их сортотипами (Артемьева, 2001, 2004). В то же время, к сегодняшнему дню накоплена лишь ограниченная информация о генетических детерминантах, определяющих проявление хозяйственно ценных биохимических признаков качества и их наследование у B. rapa . Одним из методов, позволяющих осуществлять идентификацию генетических детерминант, определяющих проявление количественных, в том числе биохимических, хозяйственно ценных признаков, является метод молекулярно-генетического картирования.

Метод молекулярно-генетического картирования (linkage mapping) позволяет определить относительные позиции ДНК-маркеров на группах сцепления. Картирование хромосомных локусов осуществляется через поиск взаимосвязей молекулярных маркеров с признаками и описывает параллельную генотипическую и фенотипическую изменчивость в картирующих популяциях. Методически идентификация и картирование осуществляется с помощью QTL (Quantitative Trait Loci – локусы количественных признаков) анализа специально созданных двуродительских расщепляющихся популяций (Чесноков, 2009).

Целью данной работы было проведение биохимического и QTL анализов и выявление молекулярных маркеров, генетически сцеп- ленных с QTL, определяющих проявление биохимических признаков качества у линий двойных гаплоидов картирующих популяций Brassica rapa L.

Материалы и методы

Материалом исследований для QTL анализа служили две картирующие популяции: DH38, полученная от скрещивания листовой/череш-ковой китайской капусты (PC-175, сорт Nai Bai Cai) и масличного желтого сарсона (YS-143, к-FIL500 – 60 линий), и DH30, полученная гибридизацией японской корнеплодной репы (VT-115, сорт Kairyou Hakata) и желтого сарсона (40 линий). Исходные для создания популяций образцы принадлежат к различным ботаническим подвидам, имеют различные продуктовые органы; генетическая дистанция между ними велика (Zhao et al., 2005). Популяции созданы в лаборатории селекции растений Университета Ваге-нингена, Нидерланды (WUR – Wageningen University and Research Centre) при использовании культуры микроспор; потомство дигапло-идных растений от единственного растения F₁ в каждой комбинации скрещивания было использовано для генотипирования и фенотипи-рования. Линии DH30 и DH38 гено-типированы с использованием 299 и 294 AFLP и SSR маркеров соответственно (Lou et al., 2007, 2008). Гомозиготные линии выращивали в Пушкинском филиале ВИР в тепличных и полевых условиях. Биохимический анализ линий по признакам содержания общего белка, аскорбиновой кислоты, β -каротина, хлорофиллов а и b проводили по общепринятым методикам (Ермаков и др., 1972).

Для расчета уровня значимости p использовали программу SYSTAT 13. QTL анализ, установление присутствия и расположение (кандидатов) QTL в группах сцепления (интервал картирования 5 сМ), значе- ния LOD (P=0,05) и степени варьирования признаков (% Expl.), которые объясняются данным QTL, для каждого признака и популяции, проводили с использованием компьютерной программы MAPQTL 6.0 (Van Ooijen, 2009). Значимость каждого LOD устанавливали тестом пермутации (1000 повторений) (Кочерина и др., 2011).

Результаты и обсуждение

В результате проведенных исследований нами выявлены QTL, контролирующие одновременно изученные биохимические признаки (табл.). Так, в популяции DH30 были выявлены QTL, контролирующие содержание β -каротина (варьирование LOD в зависимости от условий выращивания 0,39-1,08), аскорбиновой кислоты (0,94-1,70), хлорофилла а (0,87-1,32), хлорофилла b (0,89-1,55), белка (0,561,17). Локусы, контролирующие все изученные биохимические признаки, имели относительно низкие значения LOD и находились преимущественно в третьей, пятой, седьмой и в девятой группах сцепления. Отдельные QTL отмечались также в шестой хромосоме.

В популяции DH38 локусы, оказывавшие влияние на проявление анализируемых биохимических признаков, находились в пятой и десятой группах сцепления. Следует отметить, что QTL, связанные с содержанием β -каротина, проявили свое действие при варьировании LOD от 0,72 до 1,12. QTL признаков содержания аскорбиновой кислоты и содержания хлорофилла а располагались в десятой хромосоме и проявляли LOD 0,62 и 1,21, соответственно. В то же время, QTL, связанный с признаком содержания хлорофилла b (LOD – 0,65) был обнаружен в пятой группе сцепления. Таким образом, у обеих картирующих популяций идентифицированы и локализованы хромосомные локусы, контролирующие пять био-

Картирование QTL биохимических признаков качества

DH30: QTL признака содержания β-каротина Группа сцепления* Позиция Локус LOD % Expl. R03 73.545 BRMS043R03 0.39 5.9 R06 25.197 KS51082 1,08 26.7 R07 64.409 SSR89 0.97 13.0 DH38: QTL признака содержания β-каротина R05 10.665 BRMS034R05 0.72 7.1 R10 17.427 FLC1 1.12 10.8 DH30: QTL признака содержания аскорбиновой кислоты R03 73.545 BRMS043R03 1.57 21.4 R03 91.619 KS50200 1,34 32.0 R03 107.893 BRMS008R03 0.94 13.4 R05 34.851 BRMS034R05 1.10 14.7 R07 64.409 SSR89 1,70 38.7 DH38: QTL признака содержания аскорбиновой кислоты R10 17.427 FLC1 0.62 6.2 DH30: QTL признака содержания хлорофилла а R05 32.544 BRMS007R05 0.87 11.7 R07 64.409 SSR89 1.19 15.8 R09 46.160 BRMS051R09 1,32 48.7 DH38: QTL признака содержания хлорофилла а R10 17.427 FLC1 1.21 11.7 DH30: QTL признака содержания хлорофилла b R05 32.544 BRMS007R05 0.89 12.0 R07 42.400 BRMS040R07 1.00 13.4 R09 46.160 BRMS051R09 1,55 36.0 R09 51.844 Ol10D08O9 0.81 11.0 DH38: QTL признака содержания хлорофилла b R05 10.665 BRMS034R05 0.65 8.9 DH30: QTL признака содержания белка R03 107.893 BRMS008R03 0.56 8.2 R06 25.197 KS51082 1.17 15.5 R09+ 51.519 Ol10D08O9 0.81 11.0 химических признаков (табл.), определяющих качество у B.rapa L.

Обращает на себя внимание относительно низкая LOD-оценка для некоторых выявленных QTL. Согласно данным литературы, LOD-оценку ниже 3-х зачастую относят к низкому уровню достоверности вследствие многократности тестирования при QTL-анализе (Lander, Botstein, 1989). По сути, LOD-оценка представляет собой установление десятичного логарифма вероятности того, что нуль-гипотеза, утверждающая, что между двумя классами рекомбинантных линий, несущих отцовский (АА) и материнский (аа) аллели, нет достоверных фенотипических различий, неверна. Так, LOD = 2 означает, что гипотеза, альтернативная нулевой, вероятнее в 102 раз, LOD = 3 – в 103 раз и т.д. В то же время, нами было показано (Кочерина и др., 2011), что при высоких LOD-значениях 1/А близка к ошибке I рода и, наоборот, при низких LOD-зна- чениях ошибка стабильно меньше 1/А, что свидетельствует о достаточной консервативности LOD-оценки. В этом случае критическое значение 3 будет соответствовать максимальной величине ошибки I рода (при р < 0,001), и, если выбрана очень высокая частная (индивидуальная) ошибка I рода, например 5 %, то высокий уровень сцепления будет достоверно найден случайным образом (Кочерина и др., 2011). При этом, как показывают полученные нами и другими исследователями данные (Bo.. rner et al., 2002; Чесноков и др., 2013), и основные, и минорные QTL часто локализуются в одних и тех же позициях в разных экспериментах и даже в разные годы опытов, поэтому LOD-оценка ниже 3-х также может приниматься во внимание.

Для исследованных биохимических признаков были выявлены генетически сцепленные с ними молекулярные маркеры. С высоким уров- нем значимости р>0,001-0,049 выделенные маркеры оказались связаны с признаками высокого содержания β-каротина, суммы хлорофиллов и низкого содержания белка.

Следует отметить, что использование маркированных линий двойных гаплоидов для поиска ассоциаций молекулярных маркеров с биохимическими признаками качества позволяет устанавливать молекулярные маркеры, достоверно сцепленные с изученными нами признаками высокого содержания аскорбиновой кислоты, β -каротина, хлорофиллов a и b и низкого содержания белка у B. rapaL. Можно предположить, что найденные молекулярные маркеры могут служить эффективным инструментом при массовом скрининге образцов коллекции и селекционного материала по биохимическим признакам качества.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ №13-04-00128.