Ранняя клеточная реакция тканей глаза на имплантацию биорезорбируемых дренажей насыщенных иммунодепрессантами с избирательным механизмом действия

Germanova VN, Sarbaeva NN, Karlova EV, Volova LT, Nefyodova IF, Radaykina MV. The early cellular reaction of eye tissues to the implantation of bioresorbable drainages saturated by immunosuppressants with a selective mechanism of action. Morfologicheskie Vedomosti – Morphological Newsletter. 2020;28(3):15-20 (3):15-20

Введение . Одной из самых актуальных проблем хирургии глаукомы на сегодняшний день является послеоперационное рубцевание, создающее препятствие на сформированных во время операции путях оттока внутриглазной жидкости [1-2]. Для решения данной проблемы были предложены различные модели дренажей, а также интра- или постоперационное применение препаратов с антипролиферативными свойствами. Тем не менее, до сих пор не найдено достаточно эффективного способа борьбы с послеоперационным рубцеванием, который не приводил бы к развитию серьезных, угрожающим зрению осложнений [3-4]. В настоящее время все больше внимания уделяют веществам, избирательно блокирующим те или иные звенья каскада воспаления и пролиферации для прямого или опосредованного снижения интенсивности процессов рубцевания [5]. К таким веществам относят и иммунодепрессанты, обладающие избирательным механизмом действия, в частности, циклоспорин А и эверолимус. Циклоспорин А – ингибитор кальцинейрина, избирательно ингибирующий функции Т-хелперов [6]. Согласно данным некоторых авторов, циклоспорин А способен как прямо, так и опосредованно ингибировать пролиферацию не только лимфоцитов, но и фибробластов, что доказано в экспериментах на культуре клеток [7-8]. Однако механизм прямого ингибирующего действия на фибробласты на настоящий момент не изучен. Эверолимус относится к ингибиторам механистической мишени рапамицина, одной из ключевых киназ, регулирующих рост и пролиферацию клеток [9]. Микромолярные дозы эверолимуса вызывают остановку клеточного цикла в фазе G1 клеточного цикла [10]. Для пролонгированной доставки данных иммунодепрессантов к зоне операции нами ранее был разработан способ насыщения биорезорбируемых дренажей из полилактида циклоспорином А и эверолимусом [11].

Цель исследования: оценить в эксперименте раннюю клеточную реакцию тканей глаза на имплантацию биорезорбируемых дренажей, насыщенных иммунодепрессантами с избирательным механизмом действия.

Материалы и методы исследования . Эксперимент выполняли на базе Института экспериментальной медицины и биотехнологии Самарского государственного медицинского университета Минздрава России после одобрения локальным комитетом по биоэтике. В ходе исследования руководствовались Хельсинкской конвенцией о гуманном обращении с экспериментальными животными, Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях, приказом Минздрава России № 199-н от 1 апреля 2016 г. «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики». Исследование было проведено на 12 кроликах породы «Советская шиншилла» весом 3-4 кг.

Всем животным выполняли противоглаукоматозное вмешательство фильтрующего типа с имплантацией дренажа на основе полилактида. При этом животные были разделены на три равные группы. Кроликам контрольной группы имплантировали дренаж, не насыщенный лекарственными препаратами. Животным первой исследуемой группы дренаж предварительно насыщали циклоспорином А путем выдерживания дренажа в растворе циклоспорина А с концентрацией препарата 1,6 мг/мл в течение 15 минут. Дренажи животных второй исследуемой группы предварительно насыщали 2% суспензией эверолимуса путем воздействия ультразвуковых волн мощностью 630 Вт, частотой 22 кГц в течение 6 минут.

Операцию проводили с применением внутримышечного наркоза (ксилазина гидрохлорид 2% и комбинированный препарат тилетамина гидрохлорид 5% + золазепам 5%). Вмешательство выполняли в верхнем сегменте глаза латеральнее верхней прямой мышцы. После разреза конъюнктивы у лимба выкраивали склеральный лоскут на ½ толщины склеры, который отсепаровывали вплоть до обнажения ткани трабекулы. Трабекулярную ткань иссекали с формированием фистулы в переднюю камеру. Дренаж в виде муфты в сложенном состоянии шириной 2 мм, длиной 5,2 мм, толщиной 150 мкм имплантировали перпендикулярно лимбу, при этом дистальный край дренажа позиционировали под склеральный лоскут, а проксимальный - между эписклерой и Теноновой капсулой. Склеральный лоскут и конъюнктиву ушивали узловыми швами. В послеоперационном периоде животным выполняли инстилляции комбинированного препарата, содержащего ципрофлоксацина гидрохлорид 0,3% и дексаметазона 0,1%.

По истечении 7 дней животных выводили из эксперимента под тиопенталовым наркозом путем передозировки препарата. Глаза животных энуклеировали и помещали в раствор нейтрального формалина 10%. Через 24 часа иссекали блок тканей зоны операции, подвергали стандартной гистологической проводке и фиксировали в парафине. Гистологические срезы изготавливали с помощью микротома МС-2 и окрашивали гематоксилином и эозином, а также гематоксилином и пикросириусом красным по стандартной методике. Для анализа отбирали по 1 репрезентативному срезу с дренажом между слоями склеры, а также между эписклерой и Теноновой капсулой. Клеточный состав внутри материала дренажа (жизнеспособные гранулоциты, мононуклеары, гигантские клетки инородных тел, фибробласты), интенсивность синтеза коллагена в дренаже, выраженность капсулы вокруг дренажа, количество кровеносных сосудов оценивали по шкале от 0 до 5. Нормальность распределения выборок проверяли с помощью критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. В дальнейшем были использованы непараметрические методы статистического анализа. Группы сравнивали между собой с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты исследования и обсуждение. Общая клеточная реакция во всех группах в изучаемые сроки характеризовалась слабовыраженными процессами воспаления с явлениями пролиферации. Все дренажи были инфильтрированы гранулоцитами без статистически достоверной разницы между группами, что характерно для данного срока заживления раны (табл. 1). В изученных срезах отмечали малое количество макрофагов и единичные гигантские клетки инородных тел во всех дренажах за исключением группы эверолимуса (рис. 1, 2). Как в дренажах группы контроля, так и в дренажах группы циклоспорина А наблюдали фибробласты от единичных клеток до значительного количества. Статистический анализ показал, что выраженность инфильтрации фибробластами была меньше в группе циклоспорина А в сравнении с контрольной группой. В дренажах, насыщенных эверолимусом, отмечали фибробласты, гранулоциты и мононуклеары в состоянии апоптоза (рис. 3).

Нарушений жизнеспособности клеток, окружающих дренаж, не выявлено. Количество новообразованных кровеносных сосудов статистически не отличалось между группами. Интенсивность синтеза коллагена внутри дренажа, выявляемая при анализе препаратов, окрашенных гематоксилином и пикросириусом красным, была наибольшей в группе контроля (рис. 4), меньшую интенсивность коллагено-неогенеза отмечали в группе циклоспорина А (рис. 5). Признаки синтеза коллагена внутри дренажа в группе эверолимуса отсутствовали (рис. 6). Отмечалось формирование соединительнотканной капсулы различной степени выраженности вокруг дренажей, при этом капсулы дренажей, насыщенных лекарственными препаратами, характеризовались меньшей степенью выраженности и состояли в большинстве случаев из 1-3 рядов молодых фибробластов (рис. 2). Большинство дренажей контрольной группы были окружены толстым слоем коллагенового матрикса, однако, встречались и экземпляры со слабовыраженной капсулой (рис. 1, 4).

Обращает на себя внимание факт инфильтрации дренажей фибробластами при минимальном количестве макрофагов в дренажах, что свидетельствует о том, что миграция, пролиферация фибробластов в ранние сроки после операции на тканях глаза, в частности,

Рис. 2. Зона имплантации дренажа, насыщенного циклоспорином А, через 7 дней после операции. Окр.: гематоксили-ном-эозином. Ув.: х280. На границе дренажа и склеры тонкая капсула из 1-2 рядов молодых фибробластов (стрелка). Умеренное количество фибробластов, мононуклеаров и гранулоцитов.

Рис. 1. Клеточный состав дренажа группы контроля через 7 дней после операции. Окр.: гематоксилином-эозин. Ув.: ×630. Иммерсия. Умеренное количество фибробластов, мононуклеаров и гранулоцитов. На границе склеры и дренажа толстая капсула из зрелых фибробластов и плотного коллагенового матрикса (стрелка).

Рис. 3. Апоптоз клеток внутри материала дренажа, насыщенного эверолимусом, через 7 дней после операции. Окр.: гематоксилином-эозином. Ув.: ×630. Иммерсия. Стрелкой указаны апоптозные тельца.

Рис. 4. Зона имплантации дренажа группы контроля через 7 дней после операции. Окр.: гематоксилин, пикросириус красный. Ув.: х70. Дренаж окружен капсулой (белая стрелка). Умеренное количество коллагена (прозрачная стрелка).

Рис. 5. Зона имплантации дренажа, насыщенного циклоспорином А, через 7 дней после операции. Окр.: гематоксилин, пикросириус красный. Ув.: х140. Небольшое количество коллагена с края дренажа (стрелка).

Рис. 6. Зона имплантации дренажа, насыщенного эверолимусом, через 7 дней после операции. Окр.: гематоксилин, пикросириус красный. Ув.: х140. Низкая плотность клеточных элементов в дренаже.

склере и конъюнктиве, происходит не за счет активирующего действия макрофагов, а предположительно, за счет присутствия во внутриглазной жидкости, протекающей через зону имплантации дренажа факторов роста.

Эти факторы, трансформирующий фактор роста, фактор роста соединительной ткани, фактор роста фибробластов, фактор роста эндотелия сосудов и некоторые другие, оказывают прямое стимулирующее влияние на фибробласты. При этом применение иммунодепрессантов сдерживает активирующее

Таблица 1 Морфологический анализ клеточной реакции на имплантацию дренажей (в баллах, m±M)
Группа	Контроль	Циклоспорин А	Эверолимус
Гранулоциты	1,88±0,23	1,88±0,30	1,38±0,33
Мононуклеары	2,00±0,00	1,13±0,301	0,38±0,181
ГКИТ	1,38±0,42	0,25±0,161	0,00±0,001
Фибробласты	3,00±0,33	2,13±0,231	0,25±0,161,2
Коллаген	2,25±0,49	1,13±0,301	0,00±0,001,2
Капсула	2,88±0,52	1,13±0,231	0,75±0,411
Сосуды	1,13±0,44	0,25±0,25	0,00±0,00
1 р<0,05 в сравнении с контрольной группой 1,2 р<0,05 в сравнении с группой циклоспорина А

влияние вышеперечисленных факторов роста на фибробласты, что выражается в уменьшении их количества в зоне имплантации дренажа в случае насыщения циклоспорином А или эверолимусом. Апоптоз клеток внутри дренажа, насыщенного эверолимусом, обусловлен высокой концентрацией вещества внутри материала дренажа. Однако отсутствие нарушений жизнеспособности клеток вокруг дренажа свидетельствует о том, что концентрации эверолимуса, выделяющиеся из дренажа вместе с током внутриглазной жидкости, а также непосредственно в окружающие ткани за счет липофильности вещества, не оказывают токсического воздействия на ткани и на ранних этапах способствуют торможению пролиферации фибробластов и формированию капсулы вокруг дренажа.

Заключение . Таким образом, насыщение биорезорбируемых дренажей на основе полилактида циклоспорином А и эверолимусом способствует снижению интенсивности формирования соединительнотканных элементов как внутри, так и вокруг дренажа в ранние сроки после операции на глазе в эксперименте.