Распространение микотоксинов в кормах летнего пастбищного рациона Rangifer tarandus в арктической зоне России

Биологический контроль с использованием микроорганизмов — перспективная альтернатива широкому применению дорогостоящих пестицидов, которые накапливаются в растениях и неблагоприятно влияют на здоровье человека. Химические пестициды также могут быть летальными для полезных обитателей почвы и вызывать появление штаммов патогенов, резистентных к фунгицидам. Они оказывают кратковременное ингибирующее действие на фитопатогенные микроорганизмы, тогда как биологические агенты негативно воздействуют на фитопатогены в течение всего вегетационного сезона (1-5).

Непатогенные почвенные бактерии живут в ассоциации с корнями высших растений, усиливая адаптивный потенциал хозяев и стимулируя их рост. В 1980 году J.W. Kloepper назвал их ризобактериями, содействующими росту растения (plant growh promoting rizobacteria, PGPR). Одной из характеристик ризосферы растений, отражающей ее заселенность микроорганизмами, служит количественное отношение R/S (rhizosphere/soil). Для большинства ризобактерий величина R/S колеблется от 2 до 25 (6). Особенностей, благодаря которым ризобактерии могут действовать как агенты биоконтроля, несколько. Это возможность конкурировать с фитопатогенами за экологические ниши (7), продуцировать различные антимикробные соединения (8-10), воздействовать на защитную систему растения (системную устойчивость), стимулировать рост растений посредством увеличения доступности для поглощения из почвы питательных веществ — азота, фосфора, аминокислот (11).

Цель настоящего обзора заключалась в сборе и систематизации данных отечественных и зарубежных исследователей о биологически активных метаболитах бактерии Bacillus subtilis , которая в настоящее время признана мощным инструментом биоконтроля.

B. subtilis может поддерживать постоянный контакт с высшими растениями и стимулировать их рост. Благодаря широкому кругу хозяев, способности формировать эндоспоры и продуцировать различные антибиотики лучше других представителей рода Bacillus вид B. subtilis пригоден в качестве агента биоконтроля (12). Бактерия обладает супрессивными качествами in vitro по отношению более чем к 20 типам фитопатогенных организмов за счет способности продуцировать значительное количество вторичных метаболитов: циклических липопептидов, полипептидов, белков и непептидных соединений (13, 14). Эти вещества, преимущественно пептиды, имеют либо рибосомальное, либо нерибосомальное происхождение (15).

Основная фракция антибиотиков B. subtilis , подавляющая фитопатогены, — нерибосомально синтезируемые пептидные производные, в основном липопептиды (15). Липопептидные антибиотики образуются при соединении β -гидроксильных остатков или β -аминогрупп и жирных кислот. Длина и разветвленность цепочек жирных кислот и заместителей аминокислот определяют свойства продукта (16).

Бактерии B. subtilis широко распространены в окружающей среде, поскольку многие дикие штаммы способны формировать биопленку на поверхности корней растений (17, 18). Циклический липопептид сурфак-тин содержит карбоксильную кислоту (3-гидрокси-13-метилтетрадекановая кислота) и семь аминокислот. Структура характеризуется наличием гептапептида, соединенного с жирной β -гидроксикислотой через лактоновую связь (19, 20). Другие аналоги сурфактина — пумилаципдин, бацирцин и лихенизин (21). Сурфактин — один из наиболее активных биосурфактантов (13, 21), известный стимулятор формирования биопленки. Частично это объясняется его действием как активатора мембраночувствительной гистидинкиназы (17, 22, 23).

Экзополимерные соединения играют важную роль в формировании биопленки, а их химическое строение влияет на ее свойства и качество (24, 25). Биопленка способствует колонизации корней бактериями и тем самым повышает локальную концентрацию антибиотиков (26). В то же время ее образование способствует повышению антимикробной устойчивости (27-29). Сурфактин обладает антибактериальной, антивирусной, ан-тигрибной, антимикоплазменной, инсектицидной и гербицидной активностью (30-34), стимулирует устойчивость к проникновению патогена, воздействуя на защитный механизм растения (35, 36). Биоконтроль фитопа-тогенного гриба Aspergillus flavus с помощью сурфактина способствует снижению контаминации растений микотоксинами (37).

Близкие по строению циклические липогептапептиды микосубти-лин, итурин и бацилломицин с мощной антигрибной и гемолитической, но ограниченной антибактериальной активностью многие авторы объединяют под общим названием итурины. Антигрибной эффект проявляется при взаимодействии с цитоплазматической мембраной клеток, при этом формируются ионопроницаемые поры (38, 39). В Китае выделен новый штамм B. subtilis , который продуцирует антибиотик jiean-пептид, близкий по строению к итурину (40). Jiean-пептид проявляет фунгицидные свойства против возбудителей болезней различных сельскохозяйственных культур (41, 42). Штамм продуцирует это биофунгицидное соединение при условии, что клетки бактерии адсорбированы на кусочках дерева.

Фенгицин (синоним плипастаин) сочетает в своем строении несколько соединений с необычной структурой: составляющие части циклических, разветвленных и редких веществ (43). Он содержит жирную β -гидроксикислоту, связанную с N-конечным декапептидом, который включает четыре β -аминокислотных остатка и редкую аминокислоту L-орнитин. С-конечный остаток пептида частично связан с остатком тирозина в положении 3, при этом сохраняется точка разветвления ацилпептида и восьмичленного циклического лактона (15). Фенгицин обладает антигрибной активностью против некоторых нитевидных грибов (44). Соединение успешно применяется для контроля Fusarium moniliforme , при этом подавляется рост мицелия и образование спор. Возможный механизм антигрибной активности фенгицина состоит во взаимодействии молекул стирола и фосфолипида в мембране, из-за чего нарушается структура мембран клеток мишени (45-47).

Ризоктицин — фосфатсодержащий олигопептидный антибиотик, синтезируемый грамположительной бактерией B. subtilis АТСС 6633 (48). Это ди- и трипептид, содержащий аминокислоту аргинин и L-2-амино-5-фосфорно-3-пентеноиковую аминокислоту, не встречающуюся в структуре белков. Ризоктицины проникают в грибную клетку через олигопептидную транспортную систему. В результате пептидазой освобождается небелковая фосфатсодержащая аминокислота, которая ингибирует синтез белка. Фос-фонатные соединения распространены среди биологически активных веществ главным образом благодаря способности влиять на карбокси- и фосфатсодержащие метаболиты (46).

Лантибиотики — рибосомально синтезируемые пептидные антибиотики с уникальными особенностями (лантионинсодержащие антибиотики). Лантионин образуется за счет рибосомального синтеза либо модификации (дегидратации серина и последующего соединения с тиолоновыми группами цистеина) (49). Свойства разных типов лантибиотиков, основанные на их структуре, неодинаковы. Лантибиотики типа А (21-38 аминокислотных остатка) имеют более линейную вторичную структуру и разрушают грамположительные клетки-мишени, формируя поры в цитоплазматической мембране.

Субтилин — 32-аминокислотный пентациклический лантибиотик, структурно связанный с низином (Lactococcus lactis), который широко используется в биозащите (50). Синтез лантибиотиков регулирует как плотность клеток, так и механизм споруляции. Биологическая активность лан-тибиотиков, образуемых грамположительной бактерией, ингибирует синтез пептидогликана и укорачивает его молекулу, что облегчает формирование пор (51). В синтезе субтилина участвуют также сериновые протеазы. Высокое содержание липопептида микосубтилина (880 мг/г) обнаружено у штамма B. subtilis — антагониста Candida sp. (18).

Эрицин S и субтилин различаются только по четырем аминокислотам, то есть антимикробные свойства обоих лантибиотиков сопоставимы. Однако эрицин А отличается от эрицина S строением кольца и расположением 16 аминокислот (16). Лантибиотик мерсацидин относится к лан-тибиотикам типа В, которые имеют более крупный размер молекул и разнообразную структуру.

Субтиломицин синтезируется B. subtilis MMA7, выделенной из морской губки Halilona simulans . Субтилозин А синтезируют несколько штаммов B. subtilis , он имеет макроциклическую структуру с тремя промежуточными связями, включая эфирные связи между сульфатом цистеина и α -углеводом аминокислоты (15). Субланцин 168 с β -метиллантиониновым мостиком и редкими для лантибиотиков двумя дисульфидными связами активен преимущественно против грамположительных бактерий.

Бактерии B. subtilis применяют в качестве продуцентов амилаз, протеаз, хитиназ, ксиланаз, липаз, глюконаз, целлюлаз и других ферментов (52, 53). Бациллы прикрепляются к грибным гифам, лизируют клеточные стенки фитопатогенного гриба и используют продукты лизиса в качестве дополнительного источника питания и энергии (54).

B. subtilis наряду с пептидными антибиотиками продуцирует поликетоны, которые служат активными агентами в биологическом контроле фитопатогенов. Поликетоны — семейство метаболитов, представляющих собой ферменты поликетонсинтетазы, которые проявляют антимикробную активность благодаря способности собирать многофункциональные полипептиды в большие пестицидные комплексы. По строению это линейные молекулы с двумя амидными связями, состоящие из разнообразных остатков и заместителей. В зависимости от строения и функций эти метаболиты объединены в следующие группы: бациллоены, дегидробациллоены, диффицидин, оксидиффицидин, макролацин (40, 43).

Внутри клеток B. subtilis 168 непосредственно после прекращения роста и перед формированием термостабильных спор вырабатывается фосфолипидный антибиотик бацилизоцин. Его активность в большей степени проявляется против эукариотического организма Sacharomyces cere-visiae , а также низших грибов Candida pseudotropicalis и Cryptococus neoformans , которые характеризуются ненитевидным ростом (55, 56).

Фосфолипиды, продуцируемые B. subtilis , проявляют антимикробную активность против грамотрицательных бактерий ( Escherichia coli , Proteus mirabilis и Pseudomonas aeruginosa ), грамположительных бактерий ( Staphylococcus aureus и Enterococcus faecalis ), Actinomyces sp . и грибов ( Aspergillus niger , Candida albicans ) (57). Обнаружено, что их антимикробный эффект усиливается с повышением температуры (до 50 ° С) и рН (до 10) (58, 59).

Некоторые штаммы B. subtilis синтезируют метаболиты, относящиеся к полиеновым антибиотикам с сопряженными двойными связями. Гексаены других штаммов B. subtilis в разной степени ингибируют рост фитопатогенных грибов Fusarium culmorum , F. sporotrichiella , F. oxysporum , Botrytis sorokiniana , Alternaria tenui и Phytophthora infestans (60).

Изокумарины представляют интересную группу фенольных соединений, которые встречаются у видов Bacillus как производные фенилпро-панола. Одиннадцать штаммов B. subtilis , выделенных из различных географических и экологических ниш, продуцируют амикумацины, отнесенные к антибиотикам изокумариновой группы. Амикумацин и бацилло-сарцин, выделенные из культуральной жидкости морской бактерии B. sub-tilis ТР-В0611, защищают растения от амбарной моли (43).

Изопрен — самый малочисленный представитель природных терпеноидов. В отличие от других бактерий, B. subtilis 6051, B. subtilis 23029 и B. subtilis 23856 выделяют летучее вещество изопрен в относительно высоких концентрациях (43). Спорулены А, В и С — три терпеноида, выделенные из спор B. subtilis , которые могут защищать споры бацилл от оксида-тивного стресса. Биологическая роль споруленов определяется споруляцией B. subtilis (43).

Некоторые штаммы B. subtilis продуцируют гиббереллины и гиббереллиноподобные вещества (61). Цитокинины — регуляторы клеточного деления и дифференциации в различных тканях растения. Они играют важную роль в росте и формировании узелков. У B. subtilis показано выделение смеси летучих соединений, главным образом 3-гидроксибутан-2-она и бутан-2,3-диола, стимулирующих рост растений (46, 57).

Индуцированная системная устойчивость — результат взаимодействия микроорганизмов и растения, особая роль в котором отводится ризо-бактериям, в частности B. subtilis . Элиситорами, запускающими защитный механизм растения, могут быть белки, липопептиды, полисахариды и другие соединения, ассоциированные с клеточной стенкой бактерии B. subtilis (61, 62). Бактериальные метаболиты, обладающие свойствами индуцированной устойчивости, включают цепочку взаимосвязанных друг с другом защитных реакций, в том числе образование активных форм кислорода, фосфорилирование белков, запуск базовых механизмов фитоиммунитета, которые приводят к развитию системной устойчивости (63, 64). Циклические липопептиды сурфактин, итурин и фенгицин способны оказывать влияние на сигнальные клетки растений, в результате чего запускаются природные иммунные реакции (65).

Соединения, которые высвобождаются из клеточной стенки фитопатогенов в результате воздействия гидролаз антагонистов, могут функционировать как элиситоры устойчивости, вызывая в растении возникновение защитных реакций: синтез фитоалексинов, активацию гидролитических ферментов, лигнификацию и т.д. Например, штамм B. subtilis AF1, выделенный из почв, супрессивных к Fusarium udum , способен индуцировать устойчивость арахиса против Aspergillus niger (66). Обнаружено, что этот штамм стимулирует накопление фенилаланинаммиаклиазы и пероксидазы, выступая в качестве индуктора устойчивости. В других системах значительные изменения в защитной реакции растительных клеток связаны с модификацией фенолов (66). Обработка суспензией клеток табака с добавлением низких концентраций сурфактина вызывает у растения активацию фосфорилирования и окислительных реакций, приводящих к гибели растительных клеток, а также проникшего в них фитопатогена (67).

Таким образом, Bacillus subtilis продуцирует значительное количество биологически активных метаболитов, имеющих разнообразную химическую структуру: циклические липопептиды, белки, полипептиды, кетоны, полиеновые соединения и ряд других. Способность бактерий синтезировать соединения определенной структуры предполагает наличие специфичного механизма действия на фитопатогенный объект, а также объясняет биологическую активность определенного штамма в отношении конкретных микроорганизмов. При подборе штаммов-продуцентов для создания эффективных биопрепаратов необходимо уделить внимание исследованию структуры и свойств активных метаболитов, которые они синтезируют, поскольку на этой основе могут быть разработаны новые экологически безопасные технологии защиты растений от фитопатогенов.