Распространение «западной» и «восточной» форм озерной лягушки Pelophylax ridibundus s. l. на территории Самарской и Саратовской областей (по данным анализа митохондриальной и ядерной ДНК)

В настоящее время среди бесхвостых амфибий выявлен ряд криптических форм различного таксономического статуса [1]. На территории Русской равнины известны «западные» и «восточные» формы у чесночниц, «номинативная» и «переднеазитская» у зеленых жаб, которые рассматриваются в качестве подвидов или видов [4, 5, 8, 9, 12].

У озерной лягушки Pelophylax ridibundus также имеются формы с неясным таксономическом статусом и требующие дальнейшего исследования [1]. На территории Поволжья отмечены две генетически дифференцированные формы – «западная» P. ridibundus и «восточная» P. cf. bedriagae . По данным анализа митохондриальной ДНК крайними северными географическими пунктами распространения «восточной» формы ранее указывались Волгоград – Уральск – Орск [7]. Позднее нами было показано, что в Поволжье (Пензенская обл.) «восточная» форма распространена до 54 параллели, а в зоне симпатрии двух форм обитают лягушки с «западными», «восточными» гаплотипами, а также экземпляры гибридного происхождения [2, 3]. Отметим, что «западная» и «восточная» формы пространственно не изолированы, достоверных морфологическим отличий между ними нами не обнаружено [3], что позволяет их рассматривать как крипти-ческие.

Данное исследование посвящено изучению распространения двух криптических форм озер-

ной лягушки на территории Самарской и Саратовской областей с использованием молекулярногенетических маркеров митохондриальной и ядерной ДНК.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Всего проанализирован 71 экз. озерной лягушки: 65 экз. из 19 географических пунктов Самарской и Саратовской областей и 6 экз. из 2-х лока-литетов пограничных с Оренбургской и Волгоградскими областями (табл. 1).

Молекулярно-генетический анализ выполнен в лаборатории молекулярной экологии и систематики животных при кафедре зоологии и экологии Пензенского государственного университета. В качестве образцов тканей для выделения ДНК использовалась часть пальца передней конечности амфибий, взятая прижизненно. ДНК выделяли по стандартной методике [11].

Использовались 2 молекулярно-генетических маркера: для митохондриальной ДНК (мтДНК), наследуемой по материнской линии – фрагмент первой субъединицы гена цитохром оксидазы COI , для ядерной ДНК (яДНК), имеющей «менделеевский» тип наследования – интрон 1 гена сывороточного альбумина SA1 [10].

Генетическое типирование, позволяющее определять принадлежность гаплотипов мт- и яДНК к «восточной» или «западной» форме проводилось по методике опубликованной нами ранее [3]. При расчете частот встречаемости гаплотипов учитывалось, что мтДНК является гаплоидной и формально может рассматриваться как один аллель, поэтому процентное соотношение аллелей и исследованных экземпляров равно. яДНК диплоидна, содержит два аллеля одного гена, соответственно доли аллелей и экземпляров той или иной формы различны в зависимости от соотношения гомо- и гетерозиготных особей. Различия частот аллелей оценивались с помощью двустороннего Классификацию биотопов, где были отловле-критерия Фишера (F, two-tailed) в программе ны озерные лягушки, проводили по методике STATISTICA (. предложенной в работе [6].

Таблица 1. Характеристика исследованного материала. Номера, указанные перед адресом, соответствуют номерам точек на картах (рис.)

№	Локалитет	Год	n	Координаты N     1      E
Самарская область
1	Елховский р-н, с. Красные дома	2012	5	53,830	50,357
2	г. Самара, пруд на ул. Бронной	2012	5	53,269	50,230
3	г. Самара, пруд на ул. 8 просека	2013	5	53,261	50,195
4	г. Самара, пруд «Нижний», Ботанического сад	2013	5	53,216	50,178
5	г. Самара, озера у платформы «Соцгород», ул. Заводская	2012	5	53,124	50,072
6	Ставропольский р-н, пос. Мордово, протока «Кольцовская воложка» Саратовское вдхр.	2011	5	53,172	49,440
7	Сызранский р-н, пруд у с. Смолькино, верховья р. Уса	2011	5	53,453	48,126
8	Большечерниговский р-н, пруд у пос. Большая Черниговка	2007	5	52,100	50,878
Оренбургская область
9	Бузулукский р-н, с. Колтубан	2012	5	52,917	51,932
Саратовская область
10	Пугачевский р-н, окр. с. Каменка (пойма р. Бол. Иргиз)	2006	2	51,937	48,692
11	Пугачевский р-н, окр. г. Пугачев (пойма р. Бол. Иргиз)	2009	2	52,000	48,848
12	Ершовский р-н, окр. с. Чапаевка (р. Б. Кушум)	2011	2	51,634	48,042
13	Хвалынский р-н, г. Хвалынск	2013	5	52,493	48,075
14	Ртищевский р-н, с. Урусово, р. Песчанка (приток р. Хопер)	2013	1	52,388	43,779
15	окр. г. Аткарск, (пойма р. Медведица)	2012	5	51,831	45,994
16	Аткарский р-н, окр. с. Приречное (пойма р. Медведица)	2006	1	51,745	44,929
17	Аткарский р-н, г. Аткарск (р. Аткара)	2009	1	51,873	44,989
18	Воскресенский р-н, о-в Чардым, Волгоградское вдхр.	2012	1	51,736	46,333
19	Лысогорский р-н, окр. с. Урицкое	2011	2	51,428	44,935
20	Балашовский р-н, с. Алмазово, (р. Хопер)	2013	3	51,552	42,917
Волгоградская область
21	Камышинский р-н, окр. пос. Щербаковка	2001	1	50,512	45,764

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Генетические характеристики исследованных экземпляров выборки представлены в таблице 2. В первую очередь отметим несоответствие частот распределения двух генетических маркеров. Если результаты анализа маркера мтДНК (COI) показали почти двукратное преобладание в общей вы- борке гаплотипов «восточной» формы: B – 63%, R – 37%, то исследования маркера яДНК (SA1) напротив – трехкратное преобладание аллелей «западной» формы: R – 89%, B – 11%. Различия частот встречаемости аллелей мт- и яДНК достоверны (р = 0,0001).

Таблица 2. Генетические характеристики озерных лягушек ( n =71) района исследований, R – аллели P. ridibundus , B – аллели P. cf. bedriagae, H – гетерозигота; экз. (%)

мтДНК – ген COI

R 26 (37) B 45 (63) Правобережье Заволжье Правобережье Заволжье 19 7 11 34 яДНК – ген SA интрон 1

R (RR) 56 (79)		H (RB) 15 (21)		B (BB) –
Правобережье	Заволжье	Правобережье	Заволжье	Правобережье	Заволжье
28	28	2	13	–	–

Комбинация маркеров – яДНК/мтДНК

R (RR)/ R 22 (31)	R (RR)/ B 34 (48)	H (RB)/ R 4 (6)	H (RB)/ B 11 (15)
Правобережье Заволжье 17              5	Правобережье   Заволжье 11              23	Правобережье Заволжье 2              2	Правобережье Заволжье –             11

Кроме того, только треть исследованных озерных лягушек (31%) имеет видоспецифичную для P. ridibundus комбинацию маркеров мт- и яДНК (R/R), т.е. диагностируется как генетически «чистая» «западная» форма. Остальные две трети ля- гушек имеют гибридное происхождение. Меньшая часть из них представлена гетерозиготными по маркеру яДНК экземплярами с мтДНК «западной» (H/R – 6%) или «восточной» (H/B – 15%) форм. Такое сочетание маркеров не противоречит отнесению их к гибридам первого поколения (F1).

Однако генетически «чистые» особи «восточной» формы, имеющие специфичные для P. cf. bedria-gae маркеры мт- и яДНК ( B/B ), среди исследованных экземпляров не выявлены (табл. 1). При отсутствии одной из родительских форм более вероятно, что гетерозиготные особи являются не гибридами F 1 , а результатом выщепления при возвратных скрещиваниях и беккроссах. С этим согласуется и большая доля лягушек (48 %) совмещающих в генотипе маркеры двух форм – яДНК «западной» формы и мтДНК «восточной». Такая комбинация маркеров ( R/B ) может возник-

А

нуть лишь при возвратных скрещиваниях гибридных экземпляров.

Географическое распределение гаплотипов мти яДНК показано на рисунке. Видно, что «восточная» форма полностью оправдывает свое на- звание, т.к. именно в заволжской части исследованного района преобладают специфичные для этой формы гаплотипы мтДНК (рис. А). Также в левобережной части располагается большая часть водоемов, в которых обитают особи несущие аллели яДНК «восточной» формы (рис. Б). Роль

Волги в закономерностях распределения аллелей разных форм озерной лягушки подтверждается статистически. По данным анализа мтДНК соотношение «западных» и «восточных» гаплотипов приблизительно составляет 2:1 на правом берегу Волги (n=30) и 1:7 в Заволжье (n=41). В том же направлении возрастает доля «восточных» аллелей яДНК – от 3% на Правобережье, до 16% в Заволжье. Различия соотношений «западных» и «восточных» аллелей на двух берегах Волги достоверны в большей степени для митохондриальной ( р = 0,0001) и в меньшей для ядерной ( р =

0.01) ДНК. Б

Рис. Распространение гаплотипов митохондриальной (А) и ядерной (Б) ДНК у озерных лягушек в районе исследования. «Западная» форма – прозрачный пунсон, «восточная» – залитый пунсон

Как указывалось выше, все исследованные экземпляры озерных лягушек делятся на две группы – «чистые» особи «западной» формы, с комбинацией маркеров мт- и яДНК ( R/R ) и «гибридные» экземпляры – гетерозиготные ( H/R , H/B ) или совмещающие маркеры двух форм ( R/B ). На правом берегу Волги доля озерных лягушек «западной» формы несколько выше, чем «гибридов» – 57% и 43%, соответственно. В Заволжье доля особей «западной» формы резко снижена (12%) и большинство экземпляров представлено «гибридами»

(88%). Различия между берегами достоверны ( р = 0,0001).

Мы также попытались оценить, существует ли зависимость биотопического распределения от генотипа исследованных озерных лягушек. Данные (табл. 3) показывают, что частота аллелей «восточной» формы возрастает в антропогенных водоемах по сравнению с естественными, а также в открытых водоемах по сравнению с полуоткрытыми и закрытыми. Однако эта зависимость выявлена пока лишь на уровне тенденции, так как не имеет значимой статистической поддержки.

Таблица 3. Биотопическое распределение генетически типированных озерных лягушек ( n =71)

Тип водоема	Естественный				Антропогенный				ИТОГО абс. (%)
	R/R	R/B	H/R	H/B	R/R	R/B	H/R	H/B
Открытый	1	4	–	1	2	8	–	6	22 (31)
Полуоткрытый	7	6	–	1	8	7	3	2	34 (48)
Закрытый	2	3	1	–	2	6	–	1	15 (21)
ИТОГО абс. (%)	10 (14)	13 (18)	1 (1)	2 (3)	12 (17)	21 (30)	3 (4)	9 (13)	71 (100)

Данные настоящего исследования, согласуются с данными полученными нами ранее для Пензенской области [2, 3], где также выявлено обитание двух криптических форм озерной лягушки, наличие гибридов между ними, а также асимметрия в распределении маркеров мт- и яДНК.

Таким образом, результаты молекулярногенетического анализа озерных лягушек обитающих на территории Самарской и Саратовской областей значительно расширяют «поволжскую» зону симпатрии и гибридизации «западной» и «восточной» форм, а также указывают на роль Волги как возможного пути расселения «восточной» формы.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках государственного задания ФГБОУ ВПО «Пензенский государственный университет» в сфере научной деятельности на 2014 – 2016 год ы.