Рассмотрение на примере линкера ASIC каналов способ создания химерного вектора на основе вектора PVAX1

Автор: Храмов А.П., Уграицкая В.М.

Журнал: Форум молодых ученых @forum-nauka

Статья в выпуске: 11 (63), 2021 года.

Бесплатный доступ

В этой статье приведены характеристики и общие сведения о структуре вектора pVAX1 и линкере ASIC каналов. Также здесь рассматривается способ его модификации для дальнейших исследований в лабораторных условиях.

Вектор, pvax1, линкер, asic-каналы, праймеры, плазмида, клонирование

Короткий адрес: https://sciup.org/140289975

IDR: 140289975

Текст научной статьи Рассмотрение на примере линкера ASIC каналов способ создания химерного вектора на основе вектора PVAX1

Линкеры ASIC каналов и подбор сайтов рестрикции для клонирования

Последовательность аминокислотных линкеров, связывающих субъединицы, была выбрана, исходя из литературных данных, структуры генов каналов и возможности клонирования в вектор pVАХ.

Ранее для контатамерных каналов ASIC1a/ ASIC2a [13] было показано, что использование линкера Asn-Asn-Asn-Asp-Ile-Asn-Asn (NNNDINN) для сшивки субъединиц позволило получить функциональные контатамерные каналы.

Подобная структура линкера была выбрана за основу.

Дополнительно линкер должен быть содержать сайты рестрикции, отсутствующие в целевых генах rASIC3 и hASIC3. Также подходящие сайты рестрикции должны содержаться в векторе для клонирования.

Анализ структуры генов позволил подобрать следующие линкеры (табл.1).

Таблица 1. Состав линкеров

	Кодируемая аминокислотная последовательность	Нуклеотидная последовательность
Линкер 1	NNVDINN	Aataatgtcgacatc aataat SalI
Линкер 2	NNQALNN	Aataa tcaagctttaaataat HindIII

Дополнительно для создания химерных конструкций были выбраны рестриктазы BglII и ЕcoR1 , также отсутствующие в целевых генах.

Подготовка вектора для клонирования

Вектор pVAX1

pVAX1 ™ представляет собой плазмидный вектор размером 3,0 т.п.н., который часто используется для клонирования генов, предназначенных для экспрессии в клетках млекопитающих.

Особенности вектора позволяют реплицировать большое количество копий в E.coli и быстро экспрессировать интересующий белок в большинстве клеток млекопитающих. Вектор содержит следующие элементы (рис.1):

- Промотор раннего цитомегаловируса человека для высокого уровня экспрессии в широком спектре клеток млекопитающих.
- Сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH) для эффективного завершения транскрипции и полиаденилирования мРНК.
- Ген устойчивости к канамицину для селекции в кишечной палочке.

3.0 kb

Comments for pVAX1 ™: 2999 bp

CMV promoter: bases 33-620

T7 promoter/priming site: bases 664-683

Multiple cloning site: bases 696-811

BGH reverse priming site: bases 823-840

BGH polyadenylation signal: bases 829-1053

Kanamycin resistance gene: bases 1226-2020 pUC origin: bases 2320-2993

Рисунок 1. Схема строения pVAX1 вектора.

Пример изменения его для работы.

В pVAX1 векторе имеются участки лишь для некоторых выбранных рестриктаз. Методом направленного мутагенеза полилинкер вектора был изменен и добавлены сайты рестрикции для рестриктаз BglII и SalI, что обеспечивало последовательное клонирование отдельных субъединиц (табл. 2).

Таблица 2. Сравнение изначальной структуры pVAX1 вектора и изменённого для дальнейших работ вектора pVAX1-new

Вектор	pVax1	pVax1-new
Последовательность cайтов рестрикции в полилинкере	Nhe1-Hind3- ЕcoR1	Nhe1- BglII-SalI-Hind3-ЕcoR1
Нуклеотидная последовательность полилинкера	GACCCAAGCTGGCTAGCGTTT AAACTTAAGCTTGGTACCGAG CTCGGATCCACTAGTCCAG…… ….GAATTC	GACCCAAGCTGGCTAGCGTTAGATCT CGAGGTCGACACTTAAGCTTGGTACC GAGCTCGGATCCACTAGTCCAG…… ….GAATTC

Рисунок 2. Модифицированный для работы pVAX1 вектор после вставки в него двух сайтов рестрикции BglII Sall

Для решения поставленной задачи нужно было получить фрагменты ДНК, содержащие соответствующие фланкирующие 5’ и 3’ нуклеотидные последовательности с сайтами рестрикции. Все фрагменты, предназначенные для последующего клонирования в вектор pVAX, не должны были иметь ошибок в последовательности, кодирующей белки канала, т.к. секвенирование целевых конструкций было невозможно из-за повторяющихся ДНК фрагментов.

Фрагменты ДНК были амплифицированы методом ПЦР с исходной матрицы (соответственно, плазмиды pcDNA3.1(rASIC3) и pcDNA3.1(hASIC3) с использованием специфичных праймеров (структура праймеров в таблицах 3 и 4). Праймеры использовались попарно для получения соответствующего фрагмента - см. Таблица 4. Все амплифицированные фрагменты были заклонированы в рAL-TA вектор (Евроген), предназначенный для быстрого клонирования продуктов ПЦР, и отсеквернированы в обоих направлениях. Далее использовались только клоны, содержащие верифицированные фрагменты, при трансляции которых в аминокислотной последовательности белков rASIC3 и hASIC3 не содержалось ошибок.

Таблица 3. Структура праймеров, использованных для амплификации

ДНК фрагментов hASIC3

Название праймера	Структура праймера
hA3-Bgl2-HA	5’ctccttagatctatgaagcccacctcaggcc 3’ 31 bp
hA3-Sal1-HArev	5’ gatgtcgacattattgagctgtgtgacaaggtagcag 3’ 37 bp
hA3-Sal1-HB	5’ aatgtcgacatcaataatatgaagcccacctcaggcc 3’ 37 bp
hA3-Hind3-HBrev	5’ttaaagcttgattattgagctgtgtgacaaggtagcag 3’ 38 bp
hA3-Hind3-HC	5’atcaagctttaaataatatgaagcccacctcaggcc 3’ 36 bp
hA3-EcoR1-HCrev	5’attggattcctagagctgtgtgacaaggtagcag 3’ 34 bp

Таблица 4. Структура праймеров, использованных для амплификации

ДНК фрагментов rASIC3

Название праймера	Структура праймера
rA3-Bgl2-RA	5’ctccttagatctatgaaacctcgctccggactg 3’ 33 bp
rA3-Sal1-RArev	5’gatgtcgacattattgagccttgtgacgaggtaacag 3’ 37 bp
rA3-Sal1-RB	5’ aatgtcgacatcaataatatgaaacctcgctccggactg 3’ 39 bp
rA3-Hind3-RBrev	5’ttaaagcttgattattgagccttgtgacgaggtaacag 3’ 38 bp
rA3-Hind3-RC	5’atcaagctttaaataatAtgaaacctcgctccggactg 3’ 38 bp

Таблица 5. Попарное использование праймеров для амплификации.

Фрагмент ДНК	Прямой праймер	Обратный праймер
H1	hA3-Bgl2-HA	hA3-Sal1-HArev
H2	hA3-Sal1-HB	hA3-Hind3-HBrev
H3	hA3-Hind3-HC	hA3-EcoR1-HCrev
R1	rA3-Bgl2-RA	rA3-Sal1-RArev
R2	rA3-Sal1-RB	rA3-Hind3-RBrev
R3	rA3-Hind3-RC	rA3-EcoR1-RCrev

Таким образом, в распоряжении были клоны, содержащие в составе вектора рAL-TA последовательности:

R1 BglII – rASIC3 — linker1- SalI (клон рAL-TA (R1))

R2 SalI - rASIC3 - linker2 -Hind3 (клон рAL-TA (R2))

R3 Hind3- rASIC3-stop-ЕcoR1(клон рAL-TA (R3))

H1 BglII – hASIC3—linker1- SalI (клон рAL-TA (H1))

H2 SalI - hASIC3- linker2- Hind3(клон рAL-TA (H2))

H3 Hind3- hASIC3-stop- ЕcoR1 (клон рAL-TA (H3))

Дальнейшая стратегия заключается в последовательном клонировании фрагментов в вектор pVAX1-new.

Список литературы Рассмотрение на примере линкера ASIC каналов способ создания химерного вектора на основе вектора PVAX1

Adelman, J.P., McCleskey, E.W. (2007) A conformation change in the extracellular domain that accomp anies desensitization of acidsensing ion channel (ASIC) 3, J. Gen. Physiol., 129, 345–350.
Allen, N.J., Attwell, D. (2002) Mo du lation of ASIC channels in rat cere bellar Purkinje neurons by ischaemiarelated signals, J. Physiol., 543, 521–529.
Alvarez de la Rosa D., Krueger S.R., Kolar A., Shao D., Fitzsimonds R.M., Canessa C.M. Distribution, subcellular localization and ontogeny of ASIC1 in the mammalian central nervous system / J. Physiol. 2003. V. 546. № 1. P. 77 – 87
Baconguis I., Bohlen C.J., Goehring A., Julius D., Gouaux E. X-ray structure of acidsensing ion channel 1-snake toxin complex reveals open state of a Na(+)-selective channel / Cell. 2014. V. 156. № 4. P. 717 – 729
Baconguis I., Gouaux E. Structural plasticity and dynamic selectivity of acid-sensing ion channel-spider toxin complexes / Nature. 2012. V. 489. № 7416. P. 400 – 405
Bargeton, B., Kellenberger, S. (2010) The contact region between three domains of the extracellular loop of ASIC1a is critical for channel function, J. Biol. Chem., 285, 13816– 13826.
Baron, A., Voilley, N., Lazdunski, M., Lingueglia, E. (2008) Acid sensing ion channels in dorsal spinal cord neurons, J. Neurosci., 28, 1498–1508.
Bartoi T., Augustinowski K., Polleichtner G., Gründer S., Ulbrich M.H. Acid-sensing ion channel (ASIC) 1a/2a heteromers have a flexible 2:1/1:2 stoichiometry / Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2014. V. 111. № 22. P. 8281 – 8286
Benos, D.J., Stanton, B.A. (1999) Func tional domains within the degene rin/epithelial sodium channel (Deg/ ENaC) superfamily of ion channels, J. Physiol., 520, 631–644.
Benson, C.J., Xie, J., Wemmie, J.A., Price, M.P., Henss, J.M., Welsh, M.J., Snyder, P.M. (2002) Heteromultimers of DEG/ENaC subunits form H+gated channels in mouse sensory neurons, Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 2338–2343.
Coric, T., Zhang, P., Todorovic, N., Canessa, C.M. (2003) The extracellu lar domain determines the kinetics of desensitization in acidsensitive ion channel 1, J. Biol. Chem., 278, 45240–45247.
Coric, T., Zheng, D., Gerstein, M., Canessa, C.M. (2005) Proton sensitivity of ASIC1 appeared with the rise of fishes by changes of residues in the region that follows TM1 in the ectodomain of the channel, J. Physiol., 568, 725–735.
Coryell M.W., Ziemann A.E., Westmoreland P.J., Haenfler J.M., Kurjakovic Z., Zha X. ming, Price M., Schnizler M.K., Wemmie J.A. Targeting ASIC1a Reduces Innate Fear and Alters Neuronal Activity in the Fear Circuit / Biol. Psychiatry. 2007. V. 62. № 10. P. 1140 – 1148
Coryell, M.W., Wunsch, A.M., Haenfler, J.M., Allen, J.E., McBride, J.L., Davidson, B.L., Wemmie, J.A. (2008) Restoring Acidsensing ion channel1a in the amygdala of knockout mice rescues fear memory but not unconditioned fear responses, J. Neuro sci., 28, 13738–13741.
Coscoy, S., de Weille, J.R., Lingueglia, E., Lazdunski, M. (1999) The pretransmembrane 1 domain of acidsensing ion channels participates in the ion pore, J. Biol. Chem., 274, 10129–10132.
Cushman, K.A., MarshHaffner, J., Adelman, J.P., McCleskey, E.W. (2007) A conformation change in the extracellular domain that accomp anies desensitization of acidsensing ion channel (ASIC) 3, J. Gen. Physiol., 129, 345–350.

Еще

Статья научная