Растворимые формы дифференцировочных лейкоцитарных антигенов при хронической обструктивной болезни легких и их связь с нарушениями легочной вентиляции

• ¹Введение . В настоящее время хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) продолжает оставаться одной из ведущих проблем клинической медицины. Высока распространенность ХОБЛ в мире: от 7,8 до 19,7% [1]. В Российской Федерации распространенность ХОБЛ, по данным одного из эпидемиологических исследований, составила 14,5% (18,7% у мужчин и 11,2% у женщин старше 30 лет) [2]. Имеется тенденция роста смертности при ХОБЛ, что составляет в Российской Федерации 16,2 случая на 100 тыс. человек в год. Неблагоприятное прогрессирующее течение хронических респираторных заболеваний в значительной мере определяется нарушениями иммунологической реактивности организма [3]. Современным направлением в изучении ХОБЛ является исследование роли иммунокомпетентных клеток, участвующих в хроническом воспалении при ХОБЛ. Иммунокомпетентные клетки, участвующие в хроническом воспалении при ХОБЛ, несут на своей поверхности мембранные антигены, которые характеризуют направление их дифференцировки [4]. Дифференци-ровочные молекулы могут иметь растворимые формы, которые обнаруживаются в сыворотке крови и, с одной стороны, отражают уровень мембранной экспрессии антигена, а с другой — способны к модуляции иммунного ответа [5]. Роль растворимых форм мембранных молекул в патогенезе ХОБЛ в настоящее время активно изучается, однако число работ по изучению этой проблемы крайне мало, а полученные данные противоречивы. Недостаточно представлено исследований, посвященных изучению характера взаимосвязей между уровнем данных молекул и нарушениями легочной вентиляция у больных ХОБЛ при различной степени тяжести заболевания.

Цель : изучить особенности содержания растворимых форм мембранных молекул и их взаимосвязи с прогрессированием заболевания при хронической обструктивной болезни легких.

Материал и методы. Обследовано 50 больных ХОБЛ в стадии обострения, находящихся на стационарном лечении в пульмонологическом отделении городской клинической больницы № 10 г. Нижнего Новгорода: 36 мужчин (72%) и 14 женщин (28%), в возрасте от 35 до 79 лет, с продолжительностью болезни от 1 года до 40 лет (Me=15 [7; 20]), стажем курения от 1 года до 66 лет (Me=35 [18; 40]). При диагностике ХОБЛ руководствовались критериями GOLD [1] и Федеральными клиническими рекомендациями по диагностике и лечению хронической обструктивной болезни легких [2].

Всем пациентам проводилось общеклиническое обследование, спирометрия, определение уровня растворимых форм дифференцировочных молекул. Выраженность одышки оценивали по шкале mMRC в баллах [1]. Исследование функции внешнего дыхания (ФВД) проводилось с использованием аппарата «Flow screen» (фирма «JAEGER», Германия). Оценивались следующие постбронходилатационные показатели: форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ), объем форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1), максимальный экспираторный поток на уровне 50 и 75% ФЖЕЛ (МОС50 и МОС75).

Определение уровня растворимых форм мембранных молекул проводили на базе Научно-исследовательского центра молекулярной биологии

и биомедицины Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского (директор Центра — профессор Новиков В. В.) иммунофермент-ным методом с использованием моноклональных антител серии ИКО и поликлональных антител, специфичных к мембранным антигенам мононуклеарных клеток крови человека, в сыворотке крови больных. Забор образцов крови осуществлялся в день поступления до начала терапии. Концентрацию растворимых форм мембранных антигенов определяли с помощью микропланшетного фотометра для имму-ноферментного анализа СТАТ-ФАКС-2100 при длине волны 450 и 630 нм; полученные данные выражали в условных единицах (усл.ед./мл). При оценке сывороточного уровня растворимых дифференцировочных молекул клеток иммунной системы образцы сыворотки крови больных сопоставлялись с результатами обследования контрольной группы, в которую вошли 30 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту.

Больные получали стандартную комплексную терапию: бронходилататоры, ингаляционные глюкокортикоиды, по показаниям — системные глюкокортикоиды, антибиотики, муколитики, оксигенотерапию.

Математическая обработка результатов проводилась при помощи пакета статистических программ Statistica 6.0, с использованием критериев ранговой корреляции Спирмана, критериев Стъюдента, Манна — Уитни, Вилкоксона, хи-квадрат. При нормальном распределении данные представлялись в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±σ), при распределении, отличном от нормального, — в виде медианы и перцентилей Me [25p;75p]. Критический уровень статистической значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.

Результаты. С учетом клинических особенностей больные были разделены на две группы: группу 1 составили 20 больных, в группу 2 вошли 30 пациентов (табл. 1).

Таблица 1

Клинические особенности больных ХОБЛ в разных группах

Клинические особенности	Группа 1 (n=20)	Группа 2 (n=30)	р
Длительность ХОБЛ, лет Me [25p;75p]	12,5 [10;20]	20 [9;30]	0,24
Длительность курения, лет Me [25p;75p]	9 [0;30] 0–50	35 [0;40] 0–66	0,049
Частота обострений в год, М + σ	1,3 + 0,5	2,3 + 0,7	0,0009
Повышение температуры тела, % больных	62%	37%	0,24
Одышка > 2 баллов, % больных	66%	93%	0,04
Нейтрофильный лейкоцитоз, % больных	не было	47%	0,02
Рентгенологические изменения в легких, % больных	33%	76%	0,04
Койко-день, М + σ	15 + 2,3	17 + 2,8	0,03

У пациентов 2-й группы по сравнению с 1-й группой в анамнезе отмечена большая приверженность к курению и более частые обострения заболевания; увеличено число больных, имеющих одышку в покое и при незначительной физической нагрузке (3–4 балла). У этих больных при поступлении чаще вы-

Таблица 2

Содержание растворимых дифференцировочных молекул и молекул гистосовместимости в сыворотке больных ХОБЛ и доноров, Me [25p;75p]

Антиген, усл.ед./мл	Доноры	Группа 1 (n=20)	Группа 2 (n=30)	р (1-2)
sCD54 суммарный	65 [62;69]	73 [63;109] *	34 [10;44] *	р=0,0006
sCD54 олигомерный	155 [142;235]	110 [98;213]	67 [39;77] *	р=0,01
sCD50	354 [336;368]	346 [310;456]	268 [172;286] *	р=0,002
sCD38 суммарный	172 [144;256]	200 [85;260]	158 [108;173] *	p=0,16
sCD38 олигомерный	257 [238;269]	120 [60;220] *	114 [89;211] *	p=0,86
sCD25	400 [385;420]	449 [401;601] *	352 [294;393] *	p=0,04
sCD8	376 [351;386]	405 [383;452]	300 [257;327] *	p=0,01
sCD95 суммарный	376 [350;397]	311 [290;1014]	221 [146;332] *	p=0,049
sCD95 олигомерный	250 [238;260]	193 [182;201]	148 [65;180] *	p=0,047
sHLA I	991 [974;1089]	1054 [768;1262]	729 [448;921] *	p=0,04
sHLA-DR	100 [96;107]	138 [74;193]	83 [58;93] *	p=0,049

Примечание: * — p <0,05 в сравнении со здоровыми донорами.

являлся нейтрофильный лейкоцитоз, а также определялись рентгенологические изменения (признаки эмфиземы легких, усиление и деформация легочного рисунка, уплощение купола диафрагмы, расширение ретростернального пространства). В стационаре средний койко-день у пациентов 2-й группы был продолжительнее. В лечении этим больным чаще назначались системные глюкокортикоиды (в 53% случаев) по сравнению с 1-й группой (в 10% случаев); различия частот достоверны при р=0,04. Также 30% больных 2-й группы требовалось назначение двух и более курсов антибактериальной терапии, что было достоверно чаще, чем в 1-й группе, где больные получили не более одного курса антибиотиков (р=0,049).

При исследовании функции внешнего дыхания у больных ХОБЛ выявлялась бронхиальная обструкция: умеренно выраженная в 1-й группе и резко выраженная во 2-й группе. Средние значения показателей ФВД (% от должных величин) в 1-й группе составили: ОФВ-6 6+13%, ФЖЕЛ — 79+25%, МОС50-4 7+ 24% , МОС75-4 2+22% ; во 2-й группе: ОФВ 1 -4 1 [37;48] % , Ф ЖЕЛ — 62+16% ; МОС50-1 8 [16;31] %, МОС25–1 6 [11;25] % . Различия между группами достоверны при р<0,05. Таким образом, 2-я группа пациентов имела более тяжелое течение ХОБЛ и более высокую степень ограничения скорости воздушного потока по сравнению 1-й группой.

При анализе содержания растворимых форм диф-ференцировочных молекул выявлены следующие закономерности (табл. 2). У пациентов 1-й группы уровень антигенов sCD54 суммарного и sCD25 был повышен, а олигомерной фракции sCD38 снижен по сравнению с контрольной группой. У больных 2-й группы содержание всех исследованных антигенов было ниже, чем у доноров, а концентрации суммарного sCD54 антигена, антигенов sCD25 и sCD38 также достоверно отличалось при сравнении с 1-й группой.

Обсуждение. При ХОБЛ были выявлены изменения со стороны растворимых форм мембранных молекул иммунных клеток, зависящие от тяжести течения заболевания и степени бронхиальной обструкции.

Уровень растворимых молекул адгезии (суммарного и олигомерного sCD54, sCD50) был ниже у больных 2-й группы по сравнению с пациентами 1-й группы и донорами. Низкий уровень растворимых форм молекул адгезии приводит к нарушению формирования иммунного синапса, хемотаксиса фагоцитов, уменьшению их адгезии, перемещению их через эндотелий, снижению освобождения от инвазии микроорганизмов через фагоцитоз [6, 7], что ведет к снижению эффективности борьбы с возбудителем воспалительного процесса при тяжелой форме ХОБЛ. В 1-й группе отмечалось достоверное увеличение суммарного sCD54 по сравнению с донорами и пациентами 2-й группы, что, вероятнее всего, объясняется активизацией процессов адгезии и миграции клеток в зоне воспаления на более ранних стадиях болезни.

В качестве предиктора, инициирующего снижение молекул адгезии у больных с тяжелым течением болезни, можно рассматривать значительные нарушения легочной вентиляции, что подтверждается положительными корреляциями между суммарным sCD54 и параметрами ФВД: ОФВ1 (r=0,6, р=0,02), МОС50 (r=0,63, р=0,03), МОС25 (r=0,7, р=0,04). Кроме этого, воздействие никотина способствовало ингибированию молекул адгезии [8]: продолжительность курения во 2-й группе была в 3,9 раз выше, чем в 1-й группе.

Достоверное снижение сывороточного уровня олигомерного sCD38, являющегося известным активационным маркером иммунологических реакций [9], у пациентов 2-й группы по сравнению с донорами, по-видимому, указывает на уменьшение его мембранной экспрессии, угнетение межклеточных взаимодействий в процессе иммунного ответа у больных с тяжелой формой болезни.

Выявленное снижение уровня sCD25 у пациентов 2-й группы по сравнению с больными 1-й группы и донорами свидетельствовало об угнетении активности Т-лимфоцитов в ходе иммунного ответа при тяжелой ХОБЛ. Одновременно с этим нарушаются процессы сдерживания гиперактивации иммунной системы, что может способствовать чрезмерной деструкции легочной ткани и ассоциироваться с тяжелым течением болезни.

Повышенный уровень sCD25 и суммарного sCD38 у пациентов 1-й группы по сравнению с донорами отражает высокую интенсивность активации Т-клеточной функции у пациентов на более ранних стадиях болезни [10], что одновременно по механизму отрицательной обратной связи адекватно тормозит гиперактивацию иммунной системы.

Уровень sCD8 и sHLA I у больных ХОБЛ 2-й подгруппы был достоверно ниже по сравнению со здоровыми лицами и пациентами 1-й подгруппы. Снижение sCD8 и sHLA I отражает уменьшение мембранной экспрессии этих молекул, нарушение модуляции Т-клеток, угнетение цитотоксического звена иммунитета и процессов апоптоза клеток. Растворимый CD8 продуцируется активированными цитотоксическими Т-клетками и служит маркером их активации. Было показано, что растворимые мономеры HLA I способны вызывать in vitro антиген-зависимую активацию CD8⁺ клеток [11], участвующих в регуляции иммунного ответа. Снижение уровня данных молекул у больных ХОБЛ, вероятнее всего, свидетельствует о нарушении механизмов супрессии избыточного иммунного ответа при тяжелом течении болезни. При этом у пациентов 1-й группы наблюдалось достоверное повышение содержания sCD8 и тенденция к увеличению sHLA I, что позволяет сделать предположение об активации цитотоксического пула клеток, а также иммунных механизмов супрессии у пациентов с более легким течением заболевания. Изменения сывороточного содержания растворимых молекул CD8, HLA I и их комплексов, ассоциированные с тяжестью ХОБЛ, были выявлены и другими авторами [12], что может указывать на участие этих молекул в патогенезе бронхообструктивных нарушений.

Следует отметить, что именно sCD8 и sHLA I в наибольшей степени были связаны с выраженностью обструктивных и рестриктивных нарушений легочной вентиляции. Уровни антигенов sCD8 и sHLA I были достоверно связаны с показателями бронхиальной обструкции и рестрикции, что подтверждалось полученными положительными корреляциями между параметрами ОФВ1, МОС50, ЖЕЛ и содержанием sCD8 (r=0,57, р=0,03; r=0,65, р=0,04; r=0,62, р=0,04 соответственно), а также положительными корреляциями между растворимыми формами молекул главного комплекса гистосовместимости I класса и ОФВ1 (r=0,47, р=0,009), МОС50 (r=0,53, р=0,01), МОС25 (r=0,56, р=0,01).

Выявленное уменьшение sHLA-DR в сыворотке крови больных ХОБЛ 2-й группы является, вероятно, свидетельством слабости гуморального и макрофагального звеньев иммунного ответа, реализуемого с участием CD4+ Т-лимфоцитов. Содержание растворимых форм sHLA-DR достоверно коррелировало с показатели бронхиальной обструкции: МОС50 (r=0,5, р=0,03) и МОС25 (r=0,63, р=0,0001).

В нашем исследовании выявлено снижение уровня обеих фракций sCD95 у пациентов 2-й группы, тогда как в 1-й группе не было обнаружено достоверных изменений концентрации sCD95. Низкий уровень сывороточного модулятора апоптоза sCD95 может способствовать усилению программируемой гибели иммунокомпетентных клеток у пациентов с тяжелым течением ХОБЛ. Обструктивные нарушения легочной вентиляции способствовали усилению запрограммированной гибели клеток: обнаружены положительные корреляции между суммарным sCD95 и ОФВ1 (r=0,52, р=0,048), МОС50 (r=0,61, р=0,05); а также между олигомерным sCD95 и ОФВ1 (r=0,43, р=0,045).

Заключение. У пациентов с тяжелым течением ХОБЛ выявлено снижение содержания всех раство- римых форм мембранных молекул, что свидетельствовало о нарушениях на различных этапах иммунного ответа. Обнаружены корреляционные связи между содержанием растворимых форм мембранных молекул и нарушениями легочной вентиляции, что подтвердило роль иммунокомпетентных клеток в патогенезе ХОБЛ. Снижение содержания растворимых форм мембранных молекул можно рассматривать в качестве предиктора прогрессирующего течения ХОБЛ. У больных со среднетяжелым течением ХОБЛ отмечалась тенденция к повышению суммарного антигена sCD54, антигенов sCD25 и sCD8, что, возможно, свидетельствовало об активации иммунного ответа на более ранних стадиях болезни.