Размножение патогенной микрофлоры под влиянием микробного сообщества почвенной экосистемы

Автор: Сидоренко М.Л., Бузолева Л.С.

Журнал: Вестник Красноярского государственного аграрного университета @vestnik-kgau

Статья в выпуске: 3, 2012 года.

Бесплатный доступ

Изучено влияние летучих метаболитов сапрофитных бактерий почвенных экосистем на размножение патогенной микрофлоры. Установлено, что на метаболическом уровне прослеживается разный характер межвидовых и родовых взаимоотношений между бактериями, оказывающий прямое влияние на их рост и размножение.

Летучие метаболиты, микрофлора почв

Короткий адрес: https://sciup.org/14082282

IDR: 14082282

Текст научной статьи Размножение патогенной микрофлоры под влиянием микробного сообщества почвенной экосистемы

Введение. В настоящее время накоплено большое количество фактов, свидетельствующих о принципиальной возможности сапрофитного существования патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды (Головачева, 1978; Сомов, 1985; Литвин, 1988; Weiss J., Seeliger H., 1975; Froun A., 1989). Особенный интерес в этом плане вызывают возбудители инфекционных болезней, которые длительно выживают в почве, воде, растительных субстратах (Сомов, Литвин, 1988). Для таких микроорганизмов утвердился термин сапрозоонозы. К ним относятся возбудитель листериозов – Listeria monocytogenes – и возбудитель Дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки (псевдотуберкулеза человека) – Yersinia pseudotuberculosis. По данным В.Я. Головачевой (1978), иерсинии способны сохраняться и размножаться в почвах до 10 лет (срок наблюдения). Сроки выживания листерий в почвах составляют 6–12 месяцев (Головачева, 1966).

Взаимоотношения в микробном мире, кроме конкурентных трофических связей, проявляются и через метаболиты, выделяемые в окружающую среду микробами в процессе своей жизнедеятельности (Ландау, 1985; Егоров, 1986; Cole, 1976; Slater, 1981). Известно, что среди метаболитов, продуцируемых микроорганизмами, есть и летучие вещества (Заварзин, 1976; Звягинцев, 1979; Labows, Mc Gineley et al., 1980; Sprecher, Hanssen, 1983). Многие исследователи (Тамбиев, Телитченко, 1971; Никитин, 1979; Freeman, Silverman, 1976; Berestetsky, Kravchenko, 1984) считают, что летучие соединения, продуцируемые микроорганизмами, могут действовать как внутри- или межвидовые регуляторы микробных сообществ. При этом отмечено как стимулирующее, так и ингибирующее действие летучих веществ микробного происхождения на размножение микроорганизмов (Babich, Stotzky, 1974; Stotsky, Schenck, 1976; Rai Bharat et al., 1981).

В связи с этим целью данной работы явилось изучение влияния летучих метаболитов сапрофитных бактерий почвенных экосистем на размножение патогенной микрофлоры.

Объекты и методы исследования. При проведении экспериментальных исследований использованы штаммы Listeria monocytogenes (“П”, “А”, “К”, 10CN, 1А, 4В, 1В, 1С, 3А, 4А, 4С, 5, 6, 7, 74-Т, 88, 10527, 2755, 75936, 5105) и Yersinia pseudotuberculosis (158, 282, 512, 907, Н-2781, Н-3515, H-557, Н-4784, Н-4783, Н-4782, Н-4781, Н-4780, Н-4786, Н-4785, Н-4788, Н-4787, Н-4789), которые были типичны по своим культуральным, серологическим и биохимическим свойствам. Штаммы листерий получены из Всероссийского государственного контрольного института ветпрепаратов (г. Москва), штаммы иерсиний – из музея Всероссийского центра по иерсиниозам и псевдотуберкулезу (НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, г. Владивосток).

В исследованиях использованы также штаммы сапрофитных бактерий, выделенные нами из естественно сложившейся микробной ассоциации буро-подзолистой и бурой лесной почв. Всего выделено 56 штаммов, 20 из которых отнесены к родам: Acinetobacter (2 штамма), Aeromonas (4 штамма), Micrococcuтs (2 штамма), Pseudomonas (7 штаммов) , Bacillus (3 штамма) , Flavobacterium (2 штамма). Для выявления наибольшего количества видового разнообразия бактерий выделение производили с помощью голодного, растительного и питательного агаров путем высева на них 1% почвенной суспензии. Идентификацию штаммов выделенных микроорганизмов проводили согласно Определителю бактерий Берджи (1997) с использованием совокупности классических методов: бактериоскопического, бактериологического, биохимического и серологического. Биохимическую активность бактерий определяли на средах Гисса и с помощью API-тестов производства bioMerieux (Франция). Идентификацию некоторых полученных штаммов проводили в лаборатории микробиологии Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН.

Сапрофитные бактерии выращивали для экспериментов на голодном агаре (ГА), растительном агаре (РА), питательном агаре (ПА). Патогенные бактерии выращивали на ПА ( Y. pseudotuberculosis ) и казеиноводрожжевом агаре с глюкозой ( L. monocytogenes ). Для сравнения действия летучих метаболитов на рост бактерий использовали ПА и РА.

Для количественной оценки действия летучих биологически активных веществ, продуцируемых сапрофитной микрофлорой почв на рост патогенных бактерий, использовали метод, предложенный Л.С. Тир-ранен (1989) в нашей модификации. Культура, действие летучих веществ которой изучали, именуется испытуемой (сапрофитные бактерии), а на которой проверялось это действие – тест-культурой (патогенные бактерии). Результаты сравнения размеров колоний выражали в миллиметрах.

Статистическую обработку данных проводили по Ф.Г. Лакину (1990). Учитывали среднюю арифметическую величину диаметра колоний, ошибку средней арифметической. Критерием оценки служила стандартная величина нормированного отклонения, с которой сравнивалось фактическое значение этого критерия для 95 %-го уровня значимости.

Результаты и их обсуждение. В результате поставленных экспериментов дана оценка степени влияния взаимодействия культур сапрофитных и патогенных бактерий посредством их летучих метаболитов. Определено 740 результатов, среди них 42 % отрицательных (случаи, когда летучие метаболиты сапрофитных микроорганизмов подавляют pocт испытуемой культуры патогенных бактерий), 30% положительных (случаи, когда летучие метаболиты стимулировали рост испытуемой микрофлоры), остальные результаты (28 % случаев) были нулевыми. Наблюдавшиеся в опытах нулевые взаимодействия могут являться слабыми положительными или слабыми отрицательными воздействиями, не учитываемыми методом исследования (рис. 1).

Полученные данные показывают, что взаимодействие через газообразные метаболиты среди исследованных бактерий распространено. Большинство из испытуемых культур выделяют ингибирующие летучие вещества, которые оказывают отрицательное действие на рост патогенных бактерий. Стимулирующее, т.е. положительное, действие культур встречается реже.

Все испытуемые культуры обладали избирательным, как ингибирующим, так и стимулирующим действием на размножение тест-культур. Спектр действия одних бактерий широк, других более узок. По всей вероятности, бактерии продуцируют разные летучие вещества, состав которых мы рассмотрим в следующих работах. Среди изученных культур не наблюдали одинаковых ни по спектру действия, ни по спектру чувствительности к влиянию их летучих метаболитов. По данным Л.С. Тирранен с сотрудниками (1980), изучающих летучие метаболиты сапрофитной микрофлоры, такие качественные различия объясняются многообразием

□ положительное влияние

□ отрицательное влияние

□ нулевое влияние

Рис. 1. Влияние сапрофитной микрофлоры почв на размножение Y.pseudotuberculosis. A – P. aeruginosa, B – P. Fluorescens, C – Micrococcuтs, D – Aeromonas, E – Acinetobacter, F – Bacillus, G – Flavobacterium

Из всех исследуемых штаммов испытуемых культур наибольшую ингибирующую активность в отношении тест-культур проявили бактерии родов Pseudomonas (табл. 1, 2). Стимулирующее действие этих бактерий наблюдалось не более чем в 28 % случаев. Наибольшую стимулирующую активность оказывали летучие метаболиты бактерий рода Aeromonas . Ингибирующее действие этих бактерий наблюдалось не более чем в 8 % случаев. Следовательно, наиболее значимое влияние на рост и размножение патогенных бактерий в исследуемых почвах оказывают псевдомонады и аэромонады.

Следует отметить, что летучие метаболиты взятых в эксперимент штаммов Flavobacterium , Bacillus (B. cereus, B. мesentericus) не оказывали заметного действия на рост патогенных бактерий, как листерий, так и иерсиний.

Таблица 1

Влияние летучих метаболитов сапрофитной микрофлоры почв на рост Listeria monocytogenes

Штаммы Listeria monocytogenes

Испытуемая культура	<		1=	о о T-	< Т-	m	m Т-	о Т-	< СО	<	о	LO	СО		н	ОО ОО	см ю о Т-	LO LO СЧ	СО со CD LO	LO О Т- LO
Pseudomonas aeruginosa шт.11	0	-	-	+	-	-	-	-	+	0	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-
Pseudomonas aeruginosa шт.2	+	-	-	+	-	-	-	-	+	0	-	0	-	-	-	-	+	-	-	-
Pseudomonas aeruginosa шт.12	0	-	-	+	-	-	-	-	+	-	0	+	-	-	-	-	-	-	-	-
Pseudomonas fluorescens шт.7	-	-	-	-	-	0	-	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	+
Pseudomonas fluorescens шт.13	-	-	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	0	-	-	-	-	+	-	-
Pseudomonas fluorescens шт.14	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	0	-	-	-	-	-	-	0	-	+
Pseudomonas fluorescens шт.6	-	-	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	0	-	-	-	-	0	-	+
Micrococcus шт. 3	+	-	+	-	+	-	0	-	+	-	-	-	+	-	-	+	0	+	-	-
Micrococcus шт. 9	+	-	+	-	+	-	0	-	-	-	-	-	+	-	-	+	0	+	-	+
Aeromonas шт. 1	+	+	+	-	+	+	+	+	0	+	+	+	+	+	+	+	+	-	+	+
Aeromonas шт. 10	+	+	+	+	+	+	0	+	0	+	+	+	-	+	+	+	+	+	+	+
Aeromonas шт. 5	+	-	+	0	+	+	+	+	0	+	+	+	-	0	+	+	+	+	+	+
Aeromonas шт. 20	+	+	+	0	+	+	+	+	0	+	+	+	-	+	+	+	+	+	+	+
Acinetobacter шт.8	-	+	0	-	0	-	-	+	+	+	-	-	+	+	-	-	-	-	-	-
Acinetobacter шт.17	-	+	0	-	0	-	-	+	0	+	-	-	+	+	-	-	+	-	-	-
Bacillus шт. 15	0	0	0	0	0	0	+	0	0	-	0	0	0	0	0	0	-	0	0	0
Bacillus шт. 19	0	0	0	0	+	0	0	0	0	0	+	0	0	0	0	0	0	0	0	-
Bacillus шт. 4	0	0	0	0	0	0	+	0	0	+	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Flavobacterium шт. 16	0	0	0	-	0	0	0	0	0	0	0	0	0	+	0	0	0	0	0	0
Flavobacterium шт. 18	0	0	0	0	0	+	0	0	0	0	-	0	0	+	0	0	0	0	-	0

Примечание: “0” – действие отсутствует; “+” – действие положительное; “-” – действие отрицательное.

Таблица 2

Влияние летучих метаболитов сапрофитной микрофлоры почв на рост Yersinia. pseudotuberculosis

Штаммы Yersinia. pseudotuberculosis

Испытуемая культура	LO т— LO CO i	T- CO ^ T	CXI т— LO	CXI co CXI	о CD	LO LO i	CO LO т—	CO T	co co T	CXI co T	T- co T	о co T	CD co T	LO co T	co co T	co T	CD co T
Pseudomonas aeruginosa шт.11	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	+	-	-	-	0	-
Pseudomonas aeruginosa шт.2	+	-	-	0	-	-	-	-	-	+	-	+	-	-	-	-	-
Pseudomonas aeruginosa шт.12	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0	-
Pseudomonas fluorescens шт.7	-	-	-	+	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-
Pseudomonas fluorescens шт.13	+	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-
Pseudomonas fluorescens шт.14	-	-	-	+	-	-	-	-	+	-	-	-	0	-	-	-	-
Pseudomonas fluorescens шт.6	-	-	-	0	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-	-	-
Micrococcus шт. 3	-	-	0	+	-	-	0	-	-	+	-	-	+	-	-	+	+
Micrococcus шт. 9	-	-	+	+	+	-	0	-	-	+	-	-	+	-	-	+	0
Aeromonas шт. 1	0	+	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Aeromonas шт. 10	+	+	-	+	+	+	+	+	-	+	+	+	+	+	+	-	+
Aeromonas шт. 5	0	+	+	+	+	-	+	+	+	+	+	+	+	0	+	+	+
Aeromonas шт. 20	-	+	+	+	+	+	+	+	-	+	+	+	+	+	+	+	+
Acinetobacter шт.8	+	-	-	-	-	0	-	+	0	+	-	-	+	+	-	+	-
Acinetobacter шт.17	+	-	-	-	-	0	-	+	+	+	-	-	+	-	-	+	+
Bacillus шт. 15	0	0	0	-	0	0	0	0	0	0	0	+	0	0	0	0	0
Bacillus шт. 19	0	0	0	0	0	0	+	0	0	-	0	0	0	0	0	0	-
Bacillus шт. 4	0	0	0	+	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	-
Flavobacterium шт. 16	0	0	0	-	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Flavobacterium шт. 18	0	0	0	-	0	0	0	0	0	0	0	0	0	+	0	0	0

Примечание:“0” – действие отсутствует; “+” – действие положительное; “-” – действие отрицательное.

Известно, что скорость роста бактерий на разных средах может быть различной. Возможно, что и накапливаемые ими метаболиты на разных средах могут отличаться как по качеству, так и по количеству. Поэтому исследовали влияние на размножение бактерий газообразных метаболитов тех же культур микроорганизмов, выращенных на питательном агаре и растительном агаре. При этом сравнительные исследования не выявили существенной разницы между действием летучих метаболитов бактерий, выращенных на разных средах (разница статистически недостоверна, p>0,05).

Таким образом, нами отмечено стимулирующее и ингибирующее действие летучих метаболитов сапрофитных почвенных бактерий на размножение патогенных бактерий. Возможно, что некоторые газообразные вещества, выделяемые сапрофитными бактериями, могут служить питанием для других сапрофитных и патогенных бактерий. Так, Д.Г. Звягинцев (1987) указывает на возможность некоторых компонентов летучих метаболитов микробного происхождения (ацетальдегид, этанол) выполнять в почвах роль питания для микроорганизмов. В работе Г.М. Ларионова (1988) приведены экспериментальные данные о том, что длительное культивирование Pseudomonas pseudomallei в экстрактах почвы привело через 6 месяцев к активизации всех штаммов ферментативных свойств и синтеза ингибитора сопутствующей микрофлоры. По мнению Л.С. Тирранен (1989), взаимодействие микроорганизмов посредством выделяемых ими газообразных веществ – широко распространенное явление, которое может играть определенную экологическую роль в природных местообитаниях. По-видимому, качественный состав летучих выделений может положительно либо отрицательно влиять на процесс потребления органических соединений.

Выводы

1. На метаболическом уровне прослеживается разный характер межвидовых и родовых взаимоотношений между бактериями, оказывающий прямое влияние на их рост и размножение.
2. Летучие соединения, продуцируемые микроорганизмами, могут действовать как внутри- или межвидовые регуляторы микробных сообществ. В этой связи размножение патогенных бактерий, обитающих в почве, может стимулироваться или угнетаться продуктами метаболизма почвенных микроорганизмов.
3. Летучие вещества, выделяемые в окружающую среду сапрофитной микрофлорой почв, оказывают непосредственное влияние на размножение L. monocytogenes и Y. pseudotuberculosis в почвенных экосистемах. При этом наибольшей ингибирующей способностью обладают летучие метаболиты бактерий рода Pseudomonas , стимулирующей – Aeromonas.

Статья научная