Разнообразие гаплотипов гена COI горбуши Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum, 1792) бассейна реки Печоры

Горбуша Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum, 1792) - проходной эпипелагический вид, обитающий в море на глубинах до 250 м, с арктическо-бореальным типом ареала, в нативную часть которого [1] входят бассейны морей Арктики (Лаптевых, Восточно-Сибирское и Чукотское) и северной части Тихого океана (Бофорта, Берингово, Охотское, Японское). Результатом работ по ее акклиматизации, проводимых в XX в. в бассейне Белого моря, явилось быстрое расширение ареала [2]. На сегодняшний день данный вид отмечен в реках на территории от Ямала до Британских островов и Исландии [3, 4]. Для горбуши характерны отсутствие жесткого хоминга и наличие альтернативного механизма -стреинга, т.е. перераспределения нерестовых потоков между районами воспроизводства разных стад [5]. Это способствовало ее стремительному и широкому распространению на приобретенной части ареала. Информацию с детальным описанием истории акклиматизационных мероприятий, а также реки, в которые данный вид заходит на нерест, и примерную численность его стад для территории европейского Северо-Востока России можно найти в ранее опубликованной нами работе [6].

Направленная интродукция, или трансплантация, является одним из путей проникновения чужеродных видов за пределы их нативного ареала. Изучение морфологических, биологических и экологических характеристик популяций вселенцев представляет значительный интерес, поскольку способствует расширению представлений о процессах адаптации вида к новым условиям.

Изучение изменчивости, выявленной с помощью молекулярно-генетических маркеров (не только нейтральных), является необходимым этапом в понимании генетических процессов, происходящих при вселении вида на новую территорию [7]. При изучении беломорской горбуши ранее было показано снижение ее генетического разнообразия, определенное на основании данных о частотах аллелей различных генов и рестрикционного анализа мтДНК [8-10].

В последнее время широко используется метод секвенирования, предоставляющий информацию о нуклеотидном составе изучаемого гена, что позволяет получить более высокий уровень полиморфизма и уточнить выводы проведенных ранее исследований «биохимической» генетики. Одним из наиболее изученных считается ген, кодирующий 1 субъединицу фермента цитохромоксидазы (COI). Этот простой ген является широко распространенным филогенетическим маркером и обладает высокой стабильностью на видовом уровне (видоспецифичен), что определило его пригодность для ДНК-штрихкодирования живых организмов, в том числе и рыб [11]. В опубликованных ранее работах по горбуше европейского Севера сведения о результатах секвенирования гена COI отсутствуют. Однако применение данного селективного маркера может дать нам дополнительную информацию о генетических процессах, происходящих при акклиматизации или саморасселении [10]. Применительно к исследуемому нами виду он характеризуется наибольшей представленностью в существующих на сегодня базах молекулярных данных (Genbank - https://www. и BOLD Systems - https://www. , чем остальные митохондриальные гены.

Цель данного исследования - описание счетных морфологических признаков и оценка генетического разнообразия горбуши р. Печоры на основании сравнения последовательностей гена COI.

Материал и методы

Отлов рыб произведен в русле р. Печоры в районе острова Малый Якшенский (66°07'41" с. ш. 52°33'18" в. д.). При выполнении мониторинговых работ в июле и августе 2017-2019 гг. применялись ставные жаберные сети с ячеей от 30 до 80 мм и высотой от 1,8 до 6 м, а также плавная сеть длиной 200 м и ячеей 45 мм. Поймано 6 экз. горбуши, для которых выполнен полный морфобиологический анализ по общепринятой методике [12]. Возраст рыб определен по чешуе [13, 14].

Пробы печеночной ткани фиксировали в 96 %-ном этиловом спирте. Тотальную ДНК удалось выделить из четырех образцов горбуши. Выделение ДНК проводили с помощью 10 %-ного раствора Chelex-100 в ddH2O. Образец помещали в 15 мкл 10 %-ного раствора Chelex-100 и инкубировали в твердотельном термостате при температуре 55 °C в течение 30 мин. при периодическом перемешивании. Далее в течение 10 мин. инкубировался при температуре 99 °C. Выделенную ДНК хранили при температуре -20 °C. Для амплификации последовательности гена COI использовали праймеры Fish F1: 5'-ТСААССАА CCACAAAGACATTGGCAC-3' и Fish R2: 5'-TAGACT TCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3' [11]. Амплификацию фрагмента проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 5 мкл ScreenMix («Евроген», Россия), 5 мкл каждого праймера (0.3 мкМ) («Евроген», Россия), 9.0 мкл ddH20 («Ambion», США) и 1.0 мкл геномной ДНК (1-100 нг).

Амплификацию проводили в термоциклере Т-100 («Биорад», США) по следующей схеме: предварительная денатурация - 95 °C (5 мин); следующие пять циклов: 90 °C (30 сек), 45°С (60 сек), 72°С (90 сек); затем 27 циклов 90 °C (30 сек), 55 °C (45 сек), 72 °C (60 сек) и финальная элонгация - 72 °C (2 мин). Продукты реакции амплификации разде- ляли методом электрофореза в 1,3 %-ном агарозном геле в 1х трисацетатном буферном растворе с бромистым этидием. В качестве маркера длины фрагментов ДНК использовали 100 bp Ladder DNA marker (100 bp-3000 bp) («Thermo Scientific», EC). Визуализацию и изъятие продуктов амплификации осуществляли при помощи трансиллюминатора UVT-1 («Биоком», Москва). Для очистки полученного продукта реакции амплификации использовали набор CleanUp Standart («Евроген», Россия). Концентрацию ДНК и ПЦР продуктов измеряли на флуориметре Qubit 3 (Invitrogen, USA). Секвенирование проводили на базе центра коллективного пользования «Молекулярная биология» Института биологии ФИЦ Коми НЦ УрО РАН на приборе НАНОФОР 05 (Россия) с использованием набора реагентов ABI Prism BigDye Terminator v. 3.1.

Сборку и множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли с применением алгоритма ClustalW в программе Меда X [15, 16]. Анализ по идентификации полученных последовательностей проводили с использованием ресурса BLAST и BOLD Systems . Полученные последовательности гена депонированы в базу данных GenBank и доступны под номерами: MZ723945-MZ723948.

Результаты и обсуждение

Данные опросов промышленных рыбаков свидетельствовали о существовании периодов с многочисленными стадами горбуши (тысячи особей), заходящей на нерест в р. Печора. Одним из таких был 2015 г., когда на тоне длиной в 1 км в магистральном русле реки попадалось до 10 экз. за сплавку. Поимки различных по плотности групп отмечались со второй половины июля и продолжались до конца августа. В последующие нечетные года (2017 и 2019) примерная численность заходящих в р. Печору рыб сократилась и оценивалась в сотни особей. В 2021 г. вновь отмечено увеличение количества мигрирующих на нерест производителей. Таким образом, численность горбуши в бассейне р. Печора является не стабильной и характеризуется значительными колебаниями.

За период наблюдений 2017 - 2019 гг. нам удалось отловить всего 6 экз., что позволило привести неполное морфологическое описание на основе меристических признаков смешанного по половому составу материала. Отличительным признаком горбуши является очень мелкая чешуя [2], что подтверждается нашими данными. Размах изменчивости количества прободенных чешуй (//) в боковой линии составил 170-183 (176.7 ± 1.8), жаберных тычинок (sp. br.) - 30-34 (32.2 ± 0.6), позвонков (vert.) - 71-74 (72.0 ± 0.5). Количество лучей в спинном плавнике D III-V - 10-12 (11.2 ± 0.2), грудном Р I - 14-17 (15.2 ± 0.5), брюшном V II - 910 (9.7 ± 0.2) и анальном A III-IV- 11-15 (13.0 ± 0.6). Стандартная длина (АС) в выборке колебалась от 412 до 517 мм (среднее - 466 мм), с общей массой тела рыб от 723 до 1 582 г (среднее - 1 162 мм). Возраст всех отловленных особей составил 1+. Соотношение полов равное - 50 % самок и 50 % сам цов. Выявленные морфологические характеристики горбуши р. Печоры соответствуют номинативной форме данного вида рыб или незначительно выходят за их пределы [2].

В результате анализа 60 образцов (банк данных NSBI) из нативной части ареала и 11 образцов из приобретенной части ареала (в том числе четыре образца из бассейна р. Печоры) удалось выявить 16 мутаций, сосредоточенных в 15 полиморфных сайтах (см. таблицу). Большая часть нуклеотидной изменчивости приходится на единичные замены (10 сайтов) и только пять сайтов содержат информативные замены нуклеотидов.

Среднее количество нуклеотидных различий на сайт (нуклеотидное разнообразие - Р) составило 0,00303±0,000024. Соотношение транзиций к трансверсиям соответствовало значению 2,4. Величина гаплотипического разнообразия (Hd) равна 0,823. Частота встречаемости гаплотипов убывает в ряду: № 5 (28 %), № 1 (25), № 3 (17), № 4 (11) и № 2 (4 %), остальные и вовсе отмечены единично. Большая часть использованных в анализе образцов (60) относится к американской части бассейна Тихого океана, что отразилось на картине распределения полученного разнообразия. Так, гаплотипы с №№ 1 по 5 являются наиболее распространенными и на 87 % представлены особями разных лет (как четных, так и нечетных) генераций из рек северо-западного побережья Северной Америки (от штата Вашингтон США до Аляски, включая Канаду). Также здесь отмечены гаплотипы с №№ 6-11 и 14, которые представлены единичными экземплярами.

Особи горбуши бассейна Белого [17] и Баренцева (наши данные) морей отнесены к гаплотипам № 1-4 (п=8). Кроме того, обнаружены единичные экземпляры рыб с гаплотипами №№ 12 и 13 (р. Кереть) и № 15 (р. Печора). Факт этих находок является интересным, однако рассуждать об их уникальности и, соответственно, какой-либо дифференциации стад горбуши на Европейском Севере преждевременно, ввиду небольшого объема материала, который был нам доступен. Известно, что скорость мутационного процесса в последовательностях, кодирующих ген COI, достаточно низка [17]. Это означает, что обнаруженные гаплотипы должны быть характерны и для рыб бассейна Охотского моря, где обитают донорские популяции, использованные при интродукции. Однако отсутствие депонированных в банках молекулярных данных подобных сведений не позволяет подтвердить наше предположение.

Проанализированные образцы тканей горбуши (11 экз.) дали возможность выявить целых семь гаплотипов гена COI для территории европейского Северо-Востока России, что является довольно высоким соотношением. Увеличение объема выборки приведет к выявлению еще большего разнообразия по исследованному гену на приобретенной части ареала изучаемого вида.

Проведенный анализ гаплотипического разнообразия последовательности гена COI горбуши позволяет предположить, что изменчивость, выявляемая с помощью селективных (находящихся под давлением отбора) маркеров, может не соответст-

Полиморфные сайты фрагмента гена COI образцов горбуши Polymorphic sites of the COI gene fragment of pink salmon samples

Гаплотип

Номер полиморфного сайта и тип замены

22 S

37 S

47 S

211 S

265 Р2

298 S

304 S

310 S

344 S

385 Р2

409 Рз

520 Р2

535 Р2

583 S

619 S

1

С

А

С

С

А

т

С

с

С

G

т

С

А

G

G

2

G

А

С

т

3

G

А

4

G

А

т

5

G

А

т

6

т

7

А

G

А

с

т

8

G

G

А

т

А

9

G

т

т

А

т

10

G

А

с

11

G

А

т

А

12

G

С

А

13

А

G

А

с

т

14

G

15

G

т

А

Условные обозначения: S - синглетные, P2 - парсимоничные с двумя вариантами, Рз - парсимоничные с тремя вариантами. Расшифровка образцов по гаплотипам: 1) MZ723946*, HQ712699, FJ998709, FJ998705, FJ998704, FJ998702, FJ998693, FJ998692, FJ998691, FJ998688, FJ998684, FJ998683, FJ998678, FJ998676, FJ998673, FJ998672, FJ998671, EU524203; 2) MZ723947* MZ723948* FJ998707; 3) HQ712701, GU440431, FJ998711, FJ998703, FJ998698, FJ998670, FJ998669, FJ998668, FJ998666, MG951608, MG951590, MG951589; 4) HQ712700, HQ712698, EU752127, FJ998706, FJ998699, FJ998665, MG951593, MG951591; 5) EU752128, EU752126, FJ998710, FJ998696, FJ998689, FJ998687, FJ998686, FJ998685, FJ998682, FJ998680, FJ998679, FJ998677, FJ998675, FJ998674, EU524208, EU524207, EU524206, EU524205, EU524204, EU524202; 6) FJ998708; 7) FJ998701; 8) FJ998700; 9) FJ998697; 10) FJ998667; 11) EU524209; 12) MG951588; 13) MG951587; 14) КХ145377; 15) MZ723945*. * - образцы из бассейна р. Печоры.

Symbols: S - singlet, Pa - parsimonic with 2 variants, Рз - parsimonic with 3 variants. Decoding of samples by haplotypes: 1) MZ723946* HQ712699, FJ998709, FJ998705, FJ998704, FJ998702, FJ998693, FJ998692, FJ998691, FJ998688, FJ998684, FJ998683, FJ998678, FJ998676, FJ998673, FJ998672, FJ998671, EU524203; 2) MZ723947* MZ723948* FJ998707; 3) HQ712701, GU440431, FJ998711, FJ998703, FJ998698, FJ998670, FJ998669, FJ998668, FJ998666, MG951608, MG951590, MG951589; 4) HQ712700, HQ712698, EU752127, FJ998706, FJ998699, FJ998665, MG951593, MG951591; 5) EU752128, EU752126, FJ998710, FJ998696, FJ998689, FJ998687, FJ998686, FJ998685, FJ998682, FJ998680, FJ998679, FJ998677, FJ998675, FJ998674, EU524208, EU524207, EU524206, EU524205, EU524204, EU524202; 6) FJ998708; 7) FJ998701; 8) FJ998700; 9) FJ998697; 10) FJ998667; 11) EU524209; 12) MG951588; 13) MG951587; 14) KX145377; 15) MZ723945*. * - samples from the Pechora River basin.

вовать известным генетическим эффектам «горлышка бутылки» и «основателя», характерных при заселении видом новой территории.

В качестве основной причины предполагается достаточно большое количество особей из разных лет генераций, использованных в процессе интродукции горбуши. Известно, что работы по интродукции горбуши на европейский Север начаты в 1956 г. с перевозки ее икры из рек острова Сахалин на Тайбольский рыбоводный завод в Мурманской области [18]. Однако промысловый возврат производителей оставался крайне нестабильным, что определило использование северных популяций горбуши в качестве донорских в ходе реализации второго этапа акклиматизации [19]. Так, с 1985 г. был начат систематический завоз икры партии из рек Ола и Яна. В результате этого в северо-европейском регионе сформировались самовоспроизводящиеся популяции горбуши разных генерализованных линий четных и нечетных лет нереста [20-22].

Заключение

Исследование ряда меристических признаков проанализированных особей горбуши р. Печоры позволяет сделать вывод о соответствии изученных экземпляров номинативной форме данного вида рыб.

Анализ нуклеотидных последовательностей гена COI небольшого числа особей горбуши позволил выявить на приобретенной части ее ареала семь гаплотипов из 15 известных на сегодняшний день. Наибольшая представленность сведений по горбуше из рек северо-западного побережья Северной Америки и полное отсутствие таковых для ее охотоморских популяций не позволяют сделать вывод об уникальности обнаруженных для рек Ке-реть и Печора гаплотипов. С высокой долей вероятности они могут быть обнаружены и в охотоморских (донорских) популяциях горбуши. Тем не менее, соотношение количества обнаруженных гаплотипов (п=7) и исследованных для этого особей (11 экз.) горбуши для указанных рек является достаточно высоким. Увеличение объема выборки приведет к выявлению большего разнообразия по исследованному гену на территории приобретенной части ареала.

Полученные нами результаты указывают на несоблюдение основных генетических эффектов «горлышка бутылки» и «основателя», характерных при заселении видом новой территории. Об этом свидетельствует и значительное количество разнообразного донорского материала, использованного в процессе интродукции горбуши [15]. Для дальнейшего продолжения работы необходим более длительный и детальный сбор не только молекулярно-генетических данных, но и полного морфологического описания генераций горбуши как нечетных, так и четных лет нереста. Привлечение других молекулярных маркеров даст больше информации о популяционной структуре горбуши на приобретенной части ареала (европейский Северо-Восток России).

Данная работа выполнена в рамках государственного задания «Распространение, систематика и пространственная организация фауны и населения животных таежных и тундровых ландшафтов и экосистем европейского северо-востока России» № АААА-А17-117112850235-2.