Разнообразие культивируемых аэробных бактерий, выделенных из линдан-загрязненных почв

Линдан (γ-гексахлорциклогексан/ γ-ГХЦГ) включен в список стойких органических загрязнителей (СОЗ) в 2009 г. и подлежит полному уничтожению и выводу из производства и применения [Vijgen et al., 2011]. Значительные количества линдана были вынесены в окружающую среду в результате его применения в сельском хозяйстве в качестве пестицида. Кроме того, территории заводов, на которых производили линдан, и прилегающие к ним районы до настоящего момента являются сильно загрязненными данным соединением

[Vijgen et al., 2011].

По химической структуре ГХЦГ представляет собой цикл из 6 углеродных атомов, у каждого из которых в качестве заместителя расположен атом хлора. В зависимости от пространственной конфигурации молекулы выделяют α-, β-, γ-, δ- изомеры [Willet, Utrich, Hites, 1998]. Строение молекулы обусловливает уникальные химические свойства, благодаря которым гексахлорциклогексаны, в том числе и линдан (γ-ГХЦГ), устойчивы к воздействию факторов внешней среды и оказывают токсическое действие на живые организмы.

Длительное присутствие в почве чужеродных

для природы химических соединений оказывает влияние на состав микробоценозов. Преимущественное развитие получают группы бактерий, устойчивые к токсическому действию данных соединений, либо способные использовать данные соединения в качестве источников углерода и энергии. В литературе описан ряд аэробных бактерий, осуществляющих разложение линдана до соединений основного обмена веществ клетки, однако при этом происходит формирование экотоксич-ных побочных продуктов, таких как 1,2,4-трихлорбензол и 2,5-дихлорфенол [Nagata et al., 2007; Lal et al., 2010; Camacho-Pérez et al., 2012; Chuang et al., 2020].

Одним из районов с высоким уровнем загрязнения линданом в России является территория ОАО «Средне-Волжский завод химикатов», расположенного в г. Чапаевске Самарской обл. [Revich et al., 2001; Vijgen et al., 2011]. Вследствие продолжительного присутствия γ-ГХЦГ в почве данной территории можно предположить, что микро-боценоз претерпел сукцессионные изменения и адаптировался к действию линдана. В связи с этим представляет интерес изучение аэробных бактерий, формирующих микрофлору данных почв.

Цель исследования – изучить разнообразие культивируемых аэробных бактерий из почв, длительное время загрязненных линданом, а также исследовать способность данных штаммов использовать в качестве источников углерода соединения, образующиеся при биодеструкции линдана.

Материалы и методы исследования

Почвенные образцы

Образцы почв были отобраны на территории ОАО «Средне-Волжский завод химикатов» (ОАО «СВЗХ») г. Чапаевск Самарской обл. в 2013 г. Отбор почв производили согласно ГОСТ 17.4.3.0182. Транспортировка и хранение почв осуществлялись с соблюдением температурного режима.

Анализ почв на содержание линдана

Пробу почвы 10 г заворачивали в фильтр «белая лента», помещали в аппарат Сокслета и экстрагировали смесью гексан : ацетон в соотношении 50 : 70 в течение 3 ч. После экстракции колбу с экстрактом охлаждали до комнатной температуры. Охлажденный экстракт сливали в делительную воронку и приливали около 150 мл дистиллированной воды, встряхивали 2 раза по 2 мин. После разделения фаз водный раствор ацетона удаляли, а гексановый экстракт сушили над безводным сульфатом натрия в течение 15‒20 мин. Высушенный экстракт помещали в грушевидную колбу и проводили отгонку гексана на ротационном испарителе при вакууме, создаваемом водоструйным насосом, и экстракт концентрировали до объема 3 мл. Полученный экстракт переливали в делительную воронку на 25 мл, в колбу добавляли 2 мл гексана, смывали остатки раствора и присоединяли к экстракту. Объём экстракта составил 5 мл. В воронку добавляли 2 мл концентрированной серной кислоты, встряхивали, после расслоения фаз кислотный слой отделяли и гексановый слой промывали 10 мл дистиллированной воды. После расслоения фаз гексановый экстракт отделяли и сушили 10 мин. над безводным сульфатом натрия, проводили анализ полученного раствора в условиях ГХ-ПИД, ГХ-ЭЗД и ГХ-МСД.

ГХ-ПИД условия: газовый хроматограф «Shi-madzu GC 2010», с пламенно-ионизационным детектором (ГХ-ПИД), кварцевой капиллярной колонкой ZB-5 длиной 30 м, диаметром 0.25 мм, толщина пленки 0.25 мкм. Начальная температура колонки 40ºС (выдержка 3 мин.), далее нагрев со скоростью 10ºС/мин., до 280ºС (выдержка 30 мин.). Температура испарителя 250ºС, детектора 300ºС. Газ-носитель – азот, деление потока 1:30, расход через колонку 1.0 мл/мин. Вводили 1.0 мкл.

ГХ-ЭЗД условия: газовый хроматограф «Shi-madzu GC 17А», с электронно-захватным детектором (ГХ-ЭЗД), кварцевой капиллярной колонкой ZB-5 длиной 30 м, диаметром 0.25 мм, толщина пленки 0.25 мкм. Начальная температура колонки 40ºС (выдержка 3 мин.), далее нагрев со скоростью 10ºС/мин., до 270ºС (выдержка 30 мин.). Температура испарителя 250ºС, детектора 300ºС. Газ-носитель – азот, деление потока 1:30, расход через колонку 1.0 мл/мин. Вводили 1.0 мкл.

ГХ-МСД условия: газовый хроматограф-масс-спектрометр «Agilent GC 7890A MS 5975C Inert XL EI/CI» с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором, кварцевой капиллярной колонкой HP-5MS длиной 30 м, диаметром 0.25 мм, толщина пленки 0.25 мкм.; электронная ионизация при энергии излучения 70 эВ; сканирование по полному ионному току в интервале m/z 20-1000 Da; газ-носитель – гелий, деление потока 1:50, расход через колонку 1.0 мл/мин; температура колонки – начальная 40ºС (выдержка 3 мин.), программирование со скоростью 10ºС/мин. до 290ºС (выдержка 30 мин.), температура испарителя – 250ºС, температура источника – 230ºС, квадруполя – 150ºС, переходной камеры – 280ºС. Вводили 1.0 мкл.

Количественную оценку содержания линдана проводили по методу абсолютной градуировки с использованием градуировочных растворов, приготовленных из ГСО состава линдана № 1855-91П.

Среды культивирования, реактивы

Минеральная среда Раймонда, состава (г/л): KH 2 PO 4 – 2.0, Na 2 HPO 4 ×12H 2 O – 7.56, NH 4 NO 3 –

• 2 .0, MgSO 4 ×7H 2 O – 0.41, Na 2 CO 3 – 0.1, CaCl 2 × 2H 2 O – 0.013. Среда Luria-Bertani (LB), состава (г/л): триптон – 10.0, дрожжевой экстракт – 5.0, NaCl – 10.0. Для получения плотных питательных сред вносили агар-агар до конечной концентрации 1.5%.

В работе использовали аналитически чистые химические реактивы, линдан (>98%), 1,2,4-три-хлорбензол (1,2,4-ТХБ) (>98%), 2,5-дихлорфенол (2,5-ДХФ) (>98%), 2,5-дихлоргидрохинон (>98%), катехол (>98%), фирмы Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany).

Накопительное культивирование

• 10    г почвенного образца помещали в колбу Эр-ленмейера объемом 250 мл, содержащую 100 мл среды Раймонда и линдан (1 г/л). Культивирование осуществляли на термостатируемой качалке Environmental Shaker-Incubator ES-20/60 («BioSan», Латвия) со скоростью 120 об/мин и 28°С.

Выделение аэробных культивируемых бактериальных штаммов

Выделение индивидуальных штаммов производили высевом суспензии накопительной культуры на агаризованную среду Раймонда с линданом с применением классического метода серийных разведений. Контроль морфологии колоний осуществляли при высеве бактериальных штаммов на ага-ризованную среду LB.

Идентификация выделенных бактерий

ДНК из чистых культур бактерий выделяли общепринятым методом [Short protocols …, 1995]. Идентификацию бактерий осуществляли при амплификации гена 16S рРНК с использованием стандартных бактериальных праймеров 27F и 1492R.

Секвенирование и анализ генов 16S рРНК

Нуклеотидные последовательности определяли с применением набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v. 3.1 (“Applied Biosystems”, США) на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 3500XL (“Applied Biosystems”, США) согласно рекомендациям производителя. Анализ нуклеотидных последовательностей осуществляли с использованием программ MEGA Х . Поиск гомологичных последовательностей проводили в базе данных EzTaxon .

Периодическое культивирование

Бактериальную культуру, взятую с плотной питательной среды, помещали в колбу Эрленмейера объемом 250 мл, содержащую 100 мл среды Рай- монда и 10 мг одного из субстратов (линдан, 1,2,4-ТХБ, 2,5-ДХФ). Культивирование проводили на термостатируемой круговой качалке (Environmental Shaker-Incubator ES 20/60, “BioSan”, Латвия) при 120 об/мин и +28ºС. Отбор образцов для анализа производили на 10-, 16- и 57-е сут. Оптическую плотность культуры измеряли на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini («Shimadzu», Япония) при Хмакс = 600 нм.

Деструкция 1,2,4-ТХБ и 2,5-ДХФ

При исследовании деструкции 1,2,4-ТХБ и 2,5-ДХФ бактериальные культуры, выращенные на среде LB и дважды отмытые в среде Раймонда переносили во флаконы с тефлоновыми крышками, содержащими 5 мл среды Раймонда и добавляли субстраты 1,2,4-ТХБ или 2,5-ДХФ до конечной концентрации 0.1 г/л. Концентрация клеток составила 1 × 106 КОЕ/мл. Культивирование осуществляли на шейкере (Environmental Shaker-Incubator ES 20/60, “BioSan”, Латвия) 200 об/мин при +28ºС и при +7ºС.

Анализ культуральной жидкости на содержание 1,2,4-ТХБ, 2,5-ДХФ и ионов хлора

ГХ-МС анализ содержания 2,5-дихлорфенола в среде культивирования проводили в хлороформном экстракте культуральной жидкости, который предварительно обезвоживали добавлением сульфата натрия, с помощью метода хромато-масс-спектрометрии (ХМС) ("Agilent 6890/5973N", США) с масс-селективным детектором, кварцевой колонкой "RESTEK RTx-5MS" ("Restek", США). В качестве газа-носителя использовали гелий, скорость потока 1 мл/мин. Объем впрыска 1.0 мкл. Режим нагревания: температура испарителя 220°С, начальная температура колонки 60°С (2-минутная экспозиция), с последующим нагреванием при 20°С мин.^-1 до 300°С. Общее время анализа 14 мин. Анализ хроматограмм проводили программой MSD Productivity ChemStation ("Agilent" , США). Расчет концентрации анализируемых веществ вели по площадям пиков в сравнении с площадью пиков контрольного образца. Эксперимент проводили в трехкратной повторности.

Эффективность деструкции 1,2,4-ТХБ и 2,5-ДХФ определяли методом ВЭЖХ. Для анализа культуральную жидкость очищали от бактериальных клеток центрифугированием (9660 g в течение 3 мин. на центрифуге miniSpin («Eppendorf», Германия)). Наличие в супернатанте 1,2,4-ТХБ и 2,5-ДХ определяли на хроматографе LC-20A («Shimadzu», Япония) с колонкой Discovery C18 (150 х 4.6 мм или 250 х 4.6 мм) («Supelco», «Sigma-Aldrich», США) и УФ-детектором при 205 нм. Анализ проводили в системе ацетонит-рил-0.1%-ный Н3РО4 (70:30). Идентификация – с помощью сравнения времени удержания на колонке исследуемых и стандартных соединений. Стандартами сравнения являлись 1,2,4-ТХБ, 2,5-ДХФ, 2,5-дихлоргидрохинон, растворенные в ацетонитриле. Количество образовавшихся продуктов оценивали по величине площади и высоте пиков на хроматограмме относительно данных величин стандартных соединений.

Наличие ионов хлора в супернатанте определяли качественно на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini («Shimadzu», Япония) при λ макс от 460 нм до 540 нм через 5 мин. после внесения в супернатант 5%-ного азотнокислого серебра.

Скорость деструкции субстрата рассчитывали по формуле

• V = (С 0 – C i ) / (t i – t 0 ),

где C 0 – концентрация субстрата в начальный момент времени, мг/л, С i - концентрация субстрата в конечный момент времени, мг/л, t i – конечный момент времени, сут, t 0 – начальный момент времени.

Статистический анализ

Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel и Statistica 6.0.

Результаты и их обсуждение

Для изучения бактериального разнообразия линдан-загрязненных почв с территории предприятия, длительное время производившего линдан и другие соединения хлорорганического ряда, было отобрано шесть образцов. Газохроматографический анализ показал, что в пяти почвенных образцах присутствует линдан (табл. 1).

Таблица 1

Содержание линдана (Y-гексахлорциклогексана) в образцах почв

Образец почвы	Линдан
	мг/кг почвы	превышение ПДК, раз
1	н.о.*	—
2	1.843	18.4
3	4.174	41.7
4	53.449	534.5
5	0.393	3.9
6	5.468	54.7

Примечание. * н.о. – не обнаружено.

Выявленные концентрации линдана в почве превышают установленное значение ПДК, составляющее 0.1 мг/кг почвы [ГН 1.2.3539-18], в среднем (за исключением образцов 1 и 4) в 30 раз. Наиболее загрязненным является образец 4, в котором ПДК превышена более чем в 500 раз. Напротив, в образце 1 линдан не обнаружен.

Полученные результаты свидетельствуют о неравномерном распределении загрязнителя по территории ОАО «СВЗХ». Однако проведенные расчеты не позволили установить достоверных зависимостей между концентрацией линдана в почве и удаленностью точки пробоотбора от зданий цехов, а также от преобладающих ветров. Вероятно, накопление линдана в тех или иных участках связано с комплексом факторов.

В результате накопительного культивирования было выделено 26 индивидуальных аэробных бактериальных штаммов. Два из них, Achromobacter sp. NE1 and Brevundimonas sp. 242, более подробно описаны в статье [Егорова, Назарова, Демаков, 2021]. Наибольшее число штаммов, устойчивых к линдану, изолировано из наиболее загрязненного почвенного образца (образец 4) (табл. 2). Они составляют 38.5% от общего числа выделенных штаммов. Несмотря на то, что в образце 1 не обнаружен линдан, из него были выделены 2 штамма, устойчивые к действию данного пестицида. Коэффициент корреляции между концентрацией линдана в почве и количеством изолированных штаммов составил 0.96, что, согласно шкале Чеддока, свидетельствует о высокой силе связи данных показателей.

Филогенетический анализ, проведенный на основании нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК, показал, что доминирующую позицию среди штаммов линдан-загрязненных почв занимают бактерии филума Proteobacteria – 95.8% (табл. 2). Среди изолированных штаммов выявлены 10 представителей класса α-Proteobacteria , родов Brevundimonas (штамм 148А), Ochrobactrum (штаммы 241, 153, 132, NE2, NE3, 140C, 265) и Rhizobium (штаммы 145b, 145C), 7 представителей класса β-Proteobacteria , рода Achromobacter (штаммы 250, 123, 147, 190, 247, М8 и 268) и 6 представителей класса γ-Proteobacteria , родов Pseudomonas (штаммы 240, 116А, 134, 127, 126) и Pseudoxanthomonas (штамм 235).

Бактериальные штаммы, выделенные из линдан-загрязеннных территорий и описанные в литературе, принадлежат родам Actinobacteria , Al-caligenes , Arthrobacter , Azotobacter , Bacillus , Burkholderia , Chromohalobacter , Citribacter , Clostridium , Desulfovibrio , Escherichia , Flavobacterium , Kokuria , Microbacterium , Pandorea , Pseudomonas , Rhodanobacter , Sphingobium, Sphingomonas , Staphylococcus , Streptomices , Trametes , Xanthomonas [Lal et al., 2010; Abhilash, Srivastava, Singh, 2011; Camacho-Pérez et al., 2012; Saez, García, Benimeli, 2017; Kumar, Pannu, 2018]. Наибольшее количество штаммов, разлагающих линдан, являются представителями родов Sphingobium и Sphingo-monas . В настоящем исследовании доминирующее положение занимают: Achromobacter (29.1%) ,

Ochrobactrum (29.1%) и Pseudomonas (20.8%).

Таблица 2

Сравнение нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изолированных штаммов с гомологичными последовательностями типовых штаммов

Накопительная культура	Штамм, (номер GenBank)	Типовой штамм (номер GenBank)	Сходствo %
L1	240 (MW674743)	Pseudomonas stutzeri ATCC17588T (CP002881)	99.86
	241 (MW674744)	Ochrobactrum quorumnocens A44T (MG835335)	99.17
L2	116A (MW674630)	Pseudomonas sichuanensis WCHPs060030T (QKVM0100012	99.33
	134 (MW674735)	Pseudomonas monteillii NBRC103158T (BBIC01000088)	100
	153 (MW674741)	Ochrobactrum quorumnocens A44T (MG835335)	99.07
	235 (MW674742)	Pseudoxanthomonas indica P15T (jgj.1118276)	99.36
L3	127 (MW674733)	Pseudomonas putida NBRC14164T (AP013070)	99.88
	250 (MW674746)	Achromobacter marplatensis B2T (EU150134)	100
L4	123 (MW674731)	Achromobacter deleyi LMG3458T (HG324053)	100
	132 (MW674734)	Ochrobactrum soli BO-7T (MH094651)	97.6
	147 (MW674739)	Achromobacter marplatensis B2T (EU150134)	100
	148A (MW674740)	Brevundimonas diminuta ATCC11568T (GL883089)	99.86
	190 (MW674749)	Achromobacter insolutus DSM23807T (CP019325)	100
	247 (MW674745)	Achromobacter marplatensis B2T (EU150134)	99.89
	M8 (MW674752)	Achromobacter marplatensis B2T (EU150134)	99.78
	NE2 (MW674750)	Ochrobactrum teleogrylli LCB8T (MK063698)	99.07
	NE3 (MW674751)	Ochrobactrum soli BO-7T (MH094651)	99.14
	NE4 (MW674753)	Sphingobacterium siyangense SY1T (EU046272)	100
L5	145b (MW674737)	Rhizobium pongamiae VKLR-01T (GQ444134)	98.67
	145C (MW674738)	Rhizobium oryzihabitans M15T (MT023790)	99.09
L6	126 (MW674732)	Pseudomonas asplenii ATCC23835T (LT629777)	99.88
	140C (MW674736)	Ochrobactrum quorumnocens A44T (MG835335)	98.56
	265 (MW674747)	Ochrobactrum quorumnocens A44T (MG835335)	99.21
	268 (MW674748)	Achromobacter deleyi LMG3458T (HG324053)	100

Стоит отметить, что штаммы рода Rhizobium выделены только из почвенного образца 5, а штамм рода Pseudoxanthomonas – из почвенного образца 2, и не обнаружены в микробных сообществах остальных исследованных образцов почв. Наибольшее разнообразие выявлено среди представителей микробоценоза образца 4. Наряду с бактериями филума Proteobacteria , выделен штамм NE4, показавший наибольшее сходство с типовым штаммом Sphingobacterium si-yangense SY1^T (EU046272), принадлежащим филуму Bacteroidetes (табл. 2). При этом в микробоценозе образца 4 не обнаружены штаммы рода Pseudomonas , встречающиеся в образцах 1, 2, 3 и 6.

Установлено, что все выделенные штаммы сохраняют жизнеспособность на протяжении 43 сут. культивирования в минеральной среде с внесением линдана. Несмотря на отсутствие активного прироста биомассы (изменение оптической плотности на 0.05–0.1 о.е. при длине волны 600 нм), в среде было зафиксировано накопление свободных ионов хлора. Полученные данные позволяют предположить, что штаммы, выделенные в настоящем исследовании, осуществляют дехлорирование линдана и частично используют его для обеспечения жизненных процессов клетки.

Культивирование штаммов на 1,2,4-ТХБ и 2,5-ДХФ показало, что наибольший интерес для дальнейшего исследования представляют штаммы NE3 и 132, идентифицированные как представители рода Ochrobactrum. Оба штамма изолированы из почвенного образца 4.

Установлено, что данные штаммы способны осуществлять деструкцию побочных продуктов биотрансформации линдана ‒ 1,2,4-ТХБ и 2,5-ДХФ в условиях культивирования при +28°С (табл. 3, 4). В случае культивирования при +7°С штаммы Ochrobac-trum sp. NE3 и Ochrobactrum sp. 132 не осуществляют разложение данных соединений.

Таблица 3 Деструкция (%) субстратов культивирования

Штамм	2,5-ДХФ (57 сут)	1,2,4-ТХБ (18 сут)
132	23.3	̶
NE3	16.1	66.7

Известно, что штаммы рода Ochrobactrum распространены в почве, ризосфере растений и сточной воде. Описан штамм O. anthropi SUBG007, в геноме которого выявлены гены, ответственные за деградацию линдана, а также ряда ксенобиотиков [Kiran, Vrinda, 2017].

Таблица 4

Удельная скорость деструкции субстратов, мг/(лхсут)

Штамм	2,5-ДХФ	1,2,4-ТХБ
132	0.65	̶
NE3	0.45	6.11

Заключение

В результате проведенных исследований установлен уровень загрязненности линданом образцов почв, отобранных на территории ОАО «СреднеВолжский завод химикатов» г. Чапаевска Самарской обл. в 2013 г. Показано, что уровень загрязнения превышает нормы ПДК в десятки и сотни раз, при этом распределение загрязнителя по территории неравномерно. Установлена высокая корреляционная зависимость между концентрацией линдана в почве и количеством выделенных штаммов, устойчивых к действию линдана. Основная доля аэробных культивируемых бактерий в составе микробоценозов данных почв представлена штаммами филума Proteobacteria , в том числе трех классов: α-, β- и γ- Proteobacteria . Из наиболее загрязненного линданом почвенного образца 4 выделен штамм, принадлежащий филуму Bacteroide-tes. Установлено, что штаммы Ochrobactrum sp. NE3 и Ochrobactrum sp. 132 осуществляют разложение побочных продуктов биотрансформации линдана (1,2,4-ТХБ и 2,5-ДХФ) и могут быть использованы в биотехнологиях очистки почвы от линдана для предотвращения накопления опасных соединений.

Работа выполнена в рамках НИОКР АААА-А19-119112290009-1 «Молекулярные механизмы адаптации микроорганизмов к факторам среды». Анализ почв методом газовой хроматографии выполнен с использованием оборудования Центра коллективного пользования «Спектроскопия и анализ органических соединений» (ЦКП «САОС»). Остальные аналитические процедуры проведены с применением оборудования ЦКП «Исследования материалов и вещества» ПФИЦ УрО РАН, анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК выполнен на оборудовании молекулярно-генетической лаборатории кафедры ботаники и генетики растений ПГНИУ.