Разнообразие культивируемых бактерий-деструкторов монохлорированных бифенилов в почвах охраняемого ландшафта

Полихлорированные бифенилы (ПХБ) уже на протяжении нескольких десятилетий являются экологической проблемой глобального масштаба. Подтверждение этому – Международное соглашение от 2001 г. (Стокгольмская конвенция), в котором указана необходимость избавления от ПХБ как в процессах производства, так и в местах складирования и в природных резервуарах [Final act ..., 2001]. Проникновение ПХБ в организмы живых существ в незначительных количествах приводит к ряду негативных последствий, проявляющихся в нарушении целостности и передачи наследственной информации, нарушении работы основных органов и систем. ПХБ обладают высокой липофильностью, за счет чего проникают в жировые ткани и переходят по цепям питания на верхние трофические уровни [Adams et al., 2016; Müller et al., 2017; Warenik-Bany et al., 2019; Reddy et al., 2019; Devi, 2020]. В большинстве работ основное внимание уделяется воздействию на животных и человека высоко хлорированных бифенилов [Adams et al., 2016; Müller et al., 2017; Warenik-Bany et al., 2019; Reddy et al., 2019; Devi, 2020; Negret-Bolagay et al., 2021]. Однако низко хлорированные конгенеры, содержащие от 1 до 3 атомов хлора в молекуле, также могут оказывать воздействие, при этом их содержание в окружающей среде обусловлено не только проникновением в природу из промышленных смесей, но и образованием в результате анаэробной деструкции высоко хлорированных бифенилов.

В настоящее время ПХБ выявлены на таких территориях, где никогда не было их производства и они не использовались для промышленных целей [Трегер, 2013; Zhang et al., 2014; Zhu et al., 2020; Negret-Bolagay et al., 2021]. Способность к трансграничному переносу за счет высокой сорбционной составляющей привела к проникновению ПХБ в новые, территориально удаленные друг от друга, биотопы [Трегер, 2013]. Присутствие опасного загрязнителя вызывает изменения в составе ценозов, и в первую очередь, в составе почвенных сообществ [Negreet-Bolagay et al., 2021]. Преимущество в выживании получают организмы, обладающие устойчивостью к негативному воздействию поллютанта, либо способные использовать данный поллютант как источник углерода и /или энергии. Основной группой организмов, наиболее быстро адаптирующихся к новым загрязнителям, являются аэробные бактерии [Negreet-Bolagay et al., 2021]. Выявление бактерий, осуществляющих разложение/трансформацию ПХБ, происходит с использованием модельных соединений, а именно незамещенного бифенила (встречающегося в природных источниках) и монохлорированных бифенилов (входящих в список ПХБ, но обладающих более низким потенциалом опасности, чем высоко хлорированные бифенилы) [Kim, Picardal, 2000; Park et al., 2001; Hatamian-Zarmi et al., 2009].

Способность к разложению ПХБ, в том числе и монохлорированных бифенилов, выявлена у штаммов родов Achromobacter, Alcaligenes, Aquamicrobium, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacillus, Brevibacterium, Castellaniella, Ceriporia, Chitinophaga, Comamonas, Cupriavidus, Enterobacter, Hydrogenophaga, Janibacter, Janthinobacterium, Luteibacter, Mesorhizobium, Ochrobactrum, Paenibacillus, Pandoraea, Phanerochaete, Pseudomonas, Rhodococcus, Shigella, Sphingobium, Sphingomonas, Stenotrophomonas, Subtercola, Talaromyces и Williamsia [Hou et al., 2000; Pieper, Seeger, 2008; Cao et al., 2011; Ponce et al., 2011; Colbert et al., 2013; Somaraja et al., 2013; Liang et al., 2014; Nam et al., 2014; Ilori et al., 2015; Hu et al., 2015; Atago et al., 2016; Shuai et al., 2016; Kour et al., 2019]. География выделения штаммов-деструкторов ПХБ обширная и охватывает все континенты. Однако преимущественными резервуарами для выявления бактерий с деградативной активностью в отношении ПХБ являются территории, длительное время загрязненные высокими концентрациями данных поллютантов [Masai et al., 1995; Furukawa, 2000; Sakai et al., 2003; Jia et al., 2008; Xu et al., 2011; Bako et al., 2021].

Цель настоящего исследования – изучение возможности развития штаммов-деструкторов хлорбифенилов в почвах, не подверженных загрязнению ПХБ.

Материалы и методы исследования

Бактериальные штаммы

Для изучения биодеградативной активности к бифенилу и хлорбифенилам были отобраны 54 аэробных бактериальных штамма, ранее выделенные из почв территории ООПТ – охраняемого ландшафта регионального значения Осинская лесная дача в кварталах 11 и 32, и хранящиеся в режиме криоконсервации (15% глицерин, -80ºС (Evosafe-seriesTM VF620-86, SNIJDERS Scientific, Holland)) в лаборатории микробиологии техногенных экосистем «ИЭГМ УрО РАН» [Бузмаков, Гатина, 2009; Егорова и др., 2017].

Реактивы, среды

В работе использовали аналитически чистые химические реактивы: бифенил (>98%), 2-хлорбифенил (2ХБ) (>98%), 3-хлорбифенил (3ХБ) (>98%), 4-хлорбифенил (4ХБ) (>98%),4-хлорбензойная кислота (4ХБК) (>98%), 3-хлорбензойная кислота (3ХБК) (>98%), 2-хлорбензойная кислота (2ХБК) (>98%) фирмы Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany).

Среда LB состава (г/л): дрожжевой экстракт – 5.0, триптон – 10.0, хлорид натрия – 10.0.

Среда К1 состава (г/л): K 2 HPO 4 ×3H 2 O - 3.2, NaH 2 PO 4 ×2H 2 O - 0.4, (NH 4 ) 2 SO 4 - 0.5, MgSO 4 ×7H 2 O - 0.15, Ca(NO 3 ) 2 - 0.01.

Для получения плотной питательной среды вносили агар-агар в концентрации 10 г/л.

Периодическое культивирование на бифениле

Штаммы после криоконсервации восстанавливали на плотной среде LB, и культивировали в термостате суховоздушном ТС-1/80 СПУ (Санкт-Петербург, Россия) при 28ºС, 7 сут. Методом посева с плотной среды в жидкую, культуры далее помещали в колбы Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 100 мл минеральной среды К1. В качестве источника углерода в колбы вносили бифенил до конечной концентрации 1.0 г/л. Культивирование проводили на термостатируемой круговой качалке (Environmental Shaker-Incubator ES 20/60, BioSan, Латвия) при 120 об/мин и 28˚С в течение 5 сут. Измерение оптической плотности культуры производили на спектрофотометре BioSpec-mini (Shimadzu, Япония), при длине волны 600 нм (ОП 600 ).

Деструкция монохлорированных бифенилов

Разложение монохлорированных бифенилов осуществляли в экспериментах с отмытыми клетками. Бактериальную культуру, предварительно выращенную в минеральной среде К1 с бифенилом в качестве источника углерода до ОП 600 =1.0 о.е., центрифугировали при 9 660 g в течение 3 мин. на центрифуге MiniSpin (Eppendorf, Germany). Клетки бактериальной культуры, ресуспендированные в среде К1, концентрировали до ОП 600 =2.0 о.е. и помещали по 1 мл во флаконы с завинчивающимися крышками. Монохлорбифенилы вносили в виде ацетонового раствора до конечной концентрации 50 мг/л. Инкубацию производили на термостатируемой круговой качалке (Environmental Shaker-Incubator ES 20/60, BioSan, Латвия) при 120 об/мин и +28˚С. Концентрацию монохлорбифенилов оценивали через 24 ч. инкубации.

Анализ концентрации монохлорбифенилов

Количественный анализ монохлорированных бифенилов проводили в условиях ГХ-МС: газовый хроматограф Agilent 6890N с масс-селективным детектором и кварцевой капиллярной колонкой НР-5MS (длина 30 м, диаметр 0.25 мм) (Agilent Technology, США). При программировании температуры согласно [Hernandez et al., 1997]. Расчет содержания хлорбифенила в каждом исследуемом образце проводили методом внутренней нормализации. На основании полученных расчетных площадей пиков оценивали содержание хлорбифенила после процесса биодеструкции.

Эффективность деструкции рассчитывали по формуле

D (%) = 100 – 2С24, где С24 – концентрация монохлорбифенила в образце через 24 ч. инкубации, 2 – коэффициент пересчета.

Анализ концентрации монохлорбензойных кислот

Наличие хлорбензойных кислот определяли методом ВЭЖХ. Для анализа культуральную жидкость очищали от бактериальных клеток центрифугированием (9 660 g, 3 мин., центрифуга miniSpin

(Eppendorf, Германия)). Наличие в надосадочной жидкости хлорбензойных кислот определяли на хроматографе LC-20A (Shimadzu, Япония) с колонкой Discovery C18 (150 х 4.6 мм или 250 х 4.6 мм) (Supelco, Sigma-Aldrich, США) и УФ-детектором при 205 нм, а также на хроматографе LicArt (Лабконцепт, Россия) с колонкой Inspire C18 (5мкМ, 250 х 4.6 мм) (Dicma Technologies Inc., Китай) и детектором UV-62 при 205 нм. Анализ проводили в системе ацетонитрил-0.1%-ный Н 3 РО 4 (70:30). Качественную идентификацию производили на основе сравнения времени удержания вещества в экспериментальном образце и времени удержания контрольных соединений (монохлорированных бензойных кислот). Количественную оценку производили методом внутренней нормализации на основании пересчета площадей пиков опытных и контрольных образцов.

Статистический анализ

Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel и Statistica 6.0.

Амплификация гена 16S pРНК

Лизис клеток штаммов для получения матрицы ДНК производили в гидроксиде натрия (100 мкл, 0.1М) с последовательным нагреванием до +98ºС и охлаждением до -20ºС. Амплификацию генов 16S рРНК на матрице ДНК бактерий осуществляли на приборе С1000 Touch (Bio-Rad, США) с универсальными бактериальными праймерами 27F и 1492R.

Определение нуклеотидной последовательности гена 16S pРНК

Определение нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК проводили с применением набора реактивов «GenSeq-100» (Синтол, Россия) на автоматическом секвенаторе Нанофор 05 (Синтол, Россия) согласно рекомендациям производителя. Анализ полученных последовательностей осуществляли с использованием программ Sequence Scanner v. 2.0, MEGA Х . Поиск гомологичных последовательностей осуществляли по международной базе данных EzBioCloud . Для построения филогенетических деревьев использовали метод «neighbor-joining» программы MEGA Х. Эволюционные расстояния рассчитывали с использованием метода «p-distance». Статистическую достоверность ветвления («bootstrap»-анализ) оценивали на основе 1000 альтернативных деревьев.

Результаты и их обсуждение

Из лабораторной коллекции были отобраны аэробные бактериальные штаммы, ранее выделенные из почв ООПТ Осинская лесная дача. В результате культивирования в минеральной среде К1 с бифенилом, как единственным источником углерода, установлено, что 32 штамма способны использовать бифенил как ростовой субстрат. Оптическая плотность жидких культур данных штаммов достигала значений 0.5– 1.2 о.е. при длине волны 600 нм. В результате дальнейшего скрининга, было установлено, что способностью к разложению монохлорированных бифенилов обладают 16 штаммов.

Анализ гена 16S рРНК показал, что штаммы-деструкторы принадлежат к родам Achromobacter , Rho-dococcus , Pseudomonas , Delftia и Stenotrophomonas (рис. 1–5). Интересно отметить, что основную долю (56.25%) среди отобранных штаммов-деструкторов монохлорбифенилов составляют штаммы рода Achromobacter (рис. 1). В литературе описано несколько представителей данного рода, способных осуществлять разложение хлорзамещенных бифенилов. На примере штаммов Achromobacter sp. B-218, Achromobacter sp. BP3 и Achromobacter sp. 3YC3 показана хромосомная и плазмидная локализация генов деструкции бифенила/ПХБ [Witzig et al., 2006; Hong et al., 2009; Ilori et al., 2015]. Наиболее подробно особенности деструкции хлорбифенилов описаны для штамма Achromobacter xylosoxidans IR08, который способен утилизировать 4,4’-диХБ без накопления токсичных промежуточных продуктов [Ilori et al., 2008a].

Штаммы рода Rhodococcus составили 18.75% от общего числа штаммов-деструкторов монохлорбифенилов, выделенных из почв ООПТ Осинская лесная дача (рис. 2), а штаммы рода Pseudomonas – 12.5% (рис. 3).

Полученные ранее данные, описанные в литературе, позволяли предположить, что представители родов Rhodococcus и Pseudomonas, среди выявленных штаммов-деструкторов, должны быть доминирующими [Masai et al., 1995; Furukawa, 2000; Park et al., 2001; Pieper, Seeger, 2008; Hatamian-Zarmi et al., 2009; Nam et al., 2014; Atago et al. 2016; Shuai et al., 2016; Егорова и др., 2017, 2018; Bhattacharya, Khare, 2017; Devi, 2020; Bako et al., 2021]. Однако полученные результаты отличаются от ожидаемых. Доминирующую позицию занимают представители рода Achromobacter. В литературе представлены единичные сообщения, о выделении штаммов данного рода, способных разлагать сложные органические соединения, в том числе хлорированные бифенилы, из незагрязненных почв [Flavia et al., 2018; Tarlachkov et al. 2020;

Hara, Takatsuka, 2022]. Большинство известных деструкторов ПХБ рода Achromobacter изолированы из почв с различной химической нагрузкой [Witzig et al., 2006; Hong et al., 2009; Ilori et al., 2015]. Вероятно, данное различие может быть обусловлено уникальностью территории, на которой производился отбор образцов почв. Данная территория не была подвержена негативному воздействию ПХБ и находится в зоне охраняемого ландшафта, что, по-видимому, способствует развитию уникальных бактериоценозов.

__Osa б riOsa?

"LosalS

Osnl6

_ Osa24

Osal

J ---------------------------------Osa3

I——Osa4

La 网切卧 "LMG 3431 (HG324051)

Osa26

A. kerstersiil^^G 3 441 (HG324052)

A. span 竝 s LMG 5911 (АҮГ70848)

A. d&leyi^-IG 3458 (HG324053)

A. piechaudii^S^C 102461 (BCTKO1000022)

---A. marplaiensis B2 (EU150134)

--------A. mucicolens LMG 26685 (HE613446)

j-A agilis LMG 3411 (HG324050)

I—J. animicus LMG 26690 (HE613448)

14 insua\is LMG 26845 (HF586506)

U. aegrifiicie^ LMG 26852 (HF5B65 07)

p■ A. ruhlandiiLMG 1866 (CADIJL010000070)

—A. insolitus DSM 23807 (CP019325)

-----------------------A. alo^era^AVA-]. (LC094463)

-----------------------------------J. aestuarii KS-M25 (MH65175 。)

且 xybsoxidcim NBR.C 15126 (CP00695 8)

-I J. denitrificans DSM 30026 (¥14907)

J. ruhlandii ATCC 15749 (AB010840)

L A. pulmonis LMG 26696 (HE79855 2)

_A 口砲勿 LMG 2685 7 (HF5 865 08)

A. dol&m LMG 26&40' (HF5&6509)

—A. v&tensilvae LMG 303 78 (LT9765 03)

0.0010

Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное для представителей рода Achromobacter на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК.

Штаммы, исследованные в настоящей работе, выделены жирным шрифтом. Анализ включал 31 нуклеотидную последовательность. Эволюционный анализ проводился в MEGA X

[Phylogenetic tree constructed for representatives of the genus Achromobacter based on analysis of the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene.

The strains studied in this work are highlighted in bold. The analysis included 31 nucleotide sequences. Evolutionary analysis was carried out in MEGA X]

「 R f;fcerens!sFXJ9.536 (OP167981)

I_ R. ox\ ： bertzo7iivorans S2-17 (KY765341)

尺 M 例 ms 飮 sNBRC 14363 (BCXBO1000074)

艮 j 第庁 DSM 44719 (FNTLOWOOOO1) 员 koreefisis DSM 44498 [TNSVO1000005) ______________兄 h-onopohus XEAU-X1L.12 (KF887492)

---   --------Л tukisamuensis JCM 11308 (jgL1102290) -------------Л. maanshayiemis DSXI44675 (jgi. 11022 8 6)

-                                 --------尺 tiaqmgeusis Z1 (MH205096)

,—R.pedocdaVCn (KT301938)

—--------Л. са/ісіііриүе/isis \IBRL 3 5 3 (JN164649)

,——旦“位 Ktm-20 (MF405107)

"I------------------- 兄痴位。必 UC33 〔 КТ301939)

-------------R gannanensis Ml (KX887333) --------------------灵 speiaei C9-5 (MK605286)

-----------------尺切#賞械 DL 2 ML 杨 6?321) -------------A. ч-r^Isimie^is NBRC 1006 0 ； (BA\W01000105) --------------R. ^iatomas DSM 44892 (jgi. 1102288)

.       ! Л qingshengii JCM 15477 (LRRJO1000O16)

i-------- 兄 baikonure^is GTC 1041 (AB071951) ------------注母七忘打血 sNBRC 14531 (ВС\таО1 00002 3)

Osa 39

OsaS

-------Osa 11 冗任^筋叩。加 NBRC 15567 (BCRM01O00055)

! --------冗 cercidiphylli ҮШ 65003 (EU325542)

'--------Л cerastii C5 (FR714842)

----------------------------------^ psychrotolerans СМА.^ 1533 (КҮЗ 17932)

R. trifolii^ (FR714S43)

氏 corynebacterioides DSM 20151 (AF430066)

0.0050 1

Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное для представителей рода Rhodococcus на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК.

Штаммы, исследованные в настоящей работе, выделены жирным шрифтом. Анализ включал 30 нуклеотидных последовательностей. Эволюционный анализ проводился в MEGA X

[Phylogenetic tree constructed for representatives of the genus Rhodococcus based on analysis of the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene.

The strains studied in this work are highlighted in bold. The analysis included 30 nucleotide sequences. Evolutionary analysis was carried out in MEGA X]

P. farris SWRI79 (GCA 019145235.1 21)

L P" piscicola P50 (LR797558)

_ P. nunensis In5 (GQ254719)

」 R 加 m 威位 NBRC 103147 (BDAF01000092) ¹P. silesiensis АЗ (KX276 592)

Bc^i^FBF102 (LOHF0100003 3)

「 P.coronqfaciens CFBP 2216 (LJRTO1000005)

】 F 齿历 (DOAB1069)

■ P. avellanae BPIC 631 (AKBS0100B74)

7 尸• саш^Ь 加白 CFBP 2341 (AJ492827)

-P. caricapapaxa^ ATCC 33615 (D84010) P. 府迎 CFBP 3225 (JYHE01000183) -P, amygdali CFBP 3206 (JYHBO1000005) P tremae CFBP 6111 (AJ492826)

-P, ₁1G3 価血 ATCC 13522 (AB021402) г       P. 5y 内拜飲@ KCTC 12500 (KI657453)

P. congelansDSM 14939 (FNJHO1000022) 尸.血如勿勿依 0 JCM 2400 (AB021378) P. cerasi 8 (LT222319)

Osa 27

П Osa 28

P sapomphilaDSM.9151 (FNTJO1000001)

sesami SI-P133 (EU912472) ----尸. c^rnicola K1S02-6 (QYUR01000006) -----P. ghrc 妙 KMM 9500 (LC011944)

0 温口

Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное для представителей рода Pseudomonas на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК.

Штаммы, исследованные в настоящей работе, выделены жирным шрифтом. Анализ включал 25 нуклеотидных последовательностей. Эволюционный анализ проводился в MEGA X

[Phylogenetic tree constructed for representatives of the genus Pseudomonas based on analysis of the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene.

The strains studied in this work are highlighted in bold. The analysis included 25 nucleotide sequences. Evolutionary analysis was carried out in MEGA X]

Выявлены единичные представители родов Delftia и Stenotrophomonas (на долю каждого приходится 6.25%) среди отобранных штаммов-деструкторов монохлорированных бифенилов (рис. 4, 5). В литературе описан штамм Stenotrophomonas maltophila GS-103, проявляющий активность в отношении 2-хлорбифенила [Somaraja et al., 2013]. Штаммы рода Delftia , осуществляющие разложение монохлорбифенилов, в настоящей работе выявлены впервые.

Рис. 4. Филогенетическое дерево, построенное для представителей рода Delftia на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК.

Штаммы, исследованные в настоящей работе, выделены жирным шрифтом. Анализ включал 6 нуклеотидных последовательностей. Эволюционный анализ проводился в MEGA X

[Phylogenetic tree constructed for representatives of the genus Delftia based on analysis of the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene.

The strains studied in this work are highlighted in bold. The analysis included 6 nucleotide sequences. Evolutionary analysis was carried out in MEGA X]

---------------Osa 13

.S 此/ raeDSM 18941 (LDJJO1000011)

£ nitritireducens DSM 12575 (LDJGO1000040)

S. pictomm JCM 9942 (BAZIO1000187)

----------------- ------------S humi DSM 1 &929 (Ы>Л01000044)

S acidaminiphila JCM 13310 (LDJOO1000053)

S mori DY006 (ON514073)

--------------------------------S koreensis DSM 17805 (LDJHO1000020)

0.0050

Рис. 5. Филогенетическое дерево, построенное для представителей рода Stenotrophomonas на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК.

Штаммы, исследованные в настоящей работе, выделены жирным шрифтом. Анализ включал 9 нуклеотидных последовательностей. Эволюционный анализ проводился в MEGA X

[Phylogenetic tree constructed for representatives of the genus Stenotrophomonas based on analysis of the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene.

The strains studied in this work are highlighted in bold. The analysis included 9 nucleotide sequences. Evolutionary analysis was carried out in MEGA X]

С использованием метода ГХ-МС установлена остаточная концентрация монохлорированных бифенилов в экспериментах по биодеградации с отмытыми клетками (табл. 1). Расчет эффективности деструкции показал, что для 2-хлорбифенила данный показатель составил 22.9–100%, для 3-хлорбифенила – 13.34–100%, а для 4-хлорбифенила – 8.74–100%. Выявлено два штамма Achromobacter sp. Osa 3 и Achromobacter sp. Osa 24, которые разлагают все три конгенера хлорбифенила на 100%. Следует отметить, что штамм Delftia sp. Osa 20 осуществляет 100%-ную деструкцию 3- и 4-хлорбифенилов, при этом не проявляет активности в отношении 2-хлорбифенила. Высокие показатели деструкции характерны для представителей родов Pseudomonas и Rhodococcus . Штаммы Rhodococcus ruber P25 и Rhodococcus wrati-slaviensis КТ112-7 осуществляют 100%-ную биоконверсию 2- и 4-хлорбифенилов за 24 ч. [Плотникова и др., 2012; Егорова и др., 2018]. Pseudomonas sp. CB-3 разлагает 100% 4-хлорбифенила в начальной концентрации 50 мг/л за 12 ч., а штамм Burkholderia xenovorans LB400 (идентифицированный в ранних работах как Pseudomonas ) осуществляет трансформацию данного субстрата на 98% за 96 ч. [Bhattacharya, Khare, 2017; Xing et al., 2020]. Штаммы, изолированные с территории Нигерии, Ralstonia sp. SA-3 и Ralstonia sp. SA-4 осуществляют разложение всех конгенеров монохлорированных бифенилов на 88–99% за 6–10 ч. при начальной концентрации 100 ppm [Adebusoye et al., 2008]. В работе Ilori с соавторами [2008] показано, что штамм Achromobacter xylosoxidans IR08 осуществляет полную биодеструкцию 2-хлорбифенила, 3-хлорбифенила и 4-хлорбифенила при начальной концентрации 0.27 ммоль/л за 96 ч. [Ilori et al., 2008b]. Таким образом, исследованные в настоящей работе бактериальные культуры не уступают по своей биодеградативной активности в отношении монохлорированных бифенилов известным штаммам, выделенным из загрязненных биотопов.

Таблица 1

Концентрация (мг/л) монохлорированных бифенилов через 24 ч. биодеструкции [Concentration (mg/l) of monochlorinated biphenyls after 24 hours of biodegradation]

Штамм	2-ХБ	3-ХБ	4-ХБ
Osa 1	23.75±0.01	26.2±0.02	45.63±0.04
Osa 3	0	0	0
Osa 4	38.55±0.02	19.52±0.08	1.98±0.02
Osa 6	9.18±0.02	6.93±0.04	19.55±0.05
Osa 7	0	43.33±0.03	0
Osa 8	19.45±0.05	0	18.51±0.02
Osa 11	13.94±0.03	0	18.23±0.03
Osa 13	24.32±0.05	33.09±0.02	14.26±0.01
Osa 16	15.95±0.04	30.78±0.02	41.52±0.02
Osa 20	50±0.1	0	0
Osa 24	0	0	0
Osa 25	0	22.51±0.04	27.68±0.05
Osa 26	15.61±0.02	19.31±0.04	36.67±0.03
Osa 27	6.83±0.01	6.24±0.03	15.32±0.02
Osa 28	3.81±0.01	5.15±0.05	5.07±0.02
Osa 29	28.71±0.02	27.71±0.03	16.15±0.03

Анализ основных метаболитов бактериальной трансформации монохлорированных бифенилов с применением метода ВЭЖХ показал, что, за исключением разложения 2-хлорбифенила штаммами Rhodo-coccus sp. Osa 11 и Delftia sp. Osa 20, в культуральной среде присутствуют монохлорированные бензойные кислоты (табл. 2).

Интересно отметить, что для штаммов Achromobacter sp. Osa 3 и Achromobacter sp. Osa 24, полностью разлагающих монохлорбифенилы, через 24 ч. инкубации в среде зафиксировано незначительное количество 2-хлорбензойной (0.678–0.889 мг/л) и 3-хлорбензойной кислот (0.014–0.041 мг/л), тогда как 4-хлорбензойная кислота накапливалась в большем количестве (4.081–4.204 мг/л). Можно предположить, что штаммы Osa 3 и Osa 24 осуществляют дальнейшую трансформацию образующихся в качестве метаболитов 2- и 3-хлорбензойных кислот.

Штамм Rhodococcus sp. Osa 11 осуществлял деструкцию 2-хлорбифенила на 72.12%, однако в его культуральной среде не обнаружены вероятные метаболиты. Полученный результат свидетельствует о разложении 2-хлорбифенила штаммом Osa 11 до соединений основного обмена клетки.

Анализ образующихся метаболитов позволяет предположить, что процесс деструкции монохлориро-ванных бифенилов штаммами, выделенными из почв ООПТ Осинская лесная дача, происходит по классическому бифенильному пути с окислением под действием бифенил диоксигеназы незамещенного кольца в молекуле хлорбифенила [Egorova et al., 2020].

Таблица 2

Концентрация (мг/л) монохлорированных бензойных кислот через 24 ч. биодеструкции [Concentration (mg/l) of monochlorinated benzoic acids after 24 hours of biodegradation]

Штамм	2-ХБК	3-ХБК	4-ХБК
Osa 1	0.108±0.001	0.164±0.002	0
Osa 3	0.889±0.001	0.014±0.002	4.081±0.004
Osa 4	0.238±0.002	0.174±0.004	2.112±0.002
Osa 6	0.554±0.002	0.039±0.001	1.315±0.002
Osa 7	0.420±0.002	3.391±0.003	3.758±0.002
Osa 8	0.215±0.003	0.093±0.001	2.054±0.001
Osa 11	0	2.304±0.004	0.789±0.001
Osa 13	0.472±0.002	0.123±0.002	1.979±0.003
Osa 16	0.079±0.001	0.104±0.002	3.667±0.002
Osa 20	0	1.346±0.004	1.863±0.002
Osa 24	0.678±0.02	0.041±0.001	4.204±0.004
Osa 25	0.365±0.001	0.192±0.002	1.892±0.003
Osa 26	0.695±0.002	5.369±0.004	3.766±0.003
Osa 27	0.011±0.001	1.430±0.003	3.637±0.003
Osa 28	0.117±0.001	1.016±0.003	2.067±0.002
Osa 29	0.285±0.002	2.748±0.002	4.563±0.003

Заключение

В результате проведенных исследований установлено, что в почвах ООПТ Осинская лесная дача присутствуют аэробные бактерии, обладающие биодеградативным потенциалом в отношении монохлориро-ванных бифенилов. Анализ филогенетического разнообразия показал, что выделенные штаммы-деструкторы принадлежат к родам Achromobacter, Rhodococcus , Pseudomonas , Stenotrophomonas, Delftia . Эффективность деструкции монохлорированных бифенилов бактериальными культурами варьировала от 8.74% до 100%. Наибольшей биодеградативной активностью характеризовались штаммы Achromobacter sp. Osa 3 и Achromobacter sp. Osa 24, осуществляющие 100%-ную деструкцию всех конгенеров монохлорбифенилов. Образование в качестве основных метаболитов монохлорированных бензойных кислот свидетельствует о том, что трансформация хлорбифенилов выделенными штаммами происходит по классическому бифенильному пути. Таким образом, выделенные из незагрязнённых ПХБ почв бактерии, обладают высоким биодеградативным потенциалом в отношении монохлорированных бифенилов.