Разнообразие культивируемых галофильных и галотолерантных актинобактерий в осадках содовых озер белозерской группы (Республика Бурятия)

Галофильные и галотолерантные актинобактерии повсеместно распространены в соленых местообитаниях, в том числе, в морских экосистемах, внутрикон-тинентальных содовых и соленых озерах, приозерных солончаках, засоленных и щелочных почвах [Hamedi et al., 2013; Malviya et al., 2014; Messaoudi et al., 2020]. В культивируемом галоалкалофильном гетеротрофном микробном сообществе содовых озер актинобактерии представляют достаточно многочисленную и разнообразную группу микроорганизмов, выделенных из содового озера Лонар Лейк и содово-соленых озер Восточно-Африканского рифта [Joshi et al., 2008; Mwirichia et al., 2010; Ronoh et al., 2013]. Наибольшее количество галофильных и галотоле-рантных актинобактерий включают роды: Nocardiopsis , Nesterenkonia , Salinispora и Streptomonospora [Hamedi et al., 2013].

В нашем исследовании было определено разнообразие культивируемых актинобактерий в осадках содовых озер Верхнее Белое и Нижнее Белое, расположенных в зоне Байкальского рифта. Локальное расположение двух озер на расстоянии примерно 1 км друг от друга и одинаковых высотах (606 м над уровнем моря) практически нивелирует изменчивость, связанную с конкретными местными различиями, такими как местные климатические эффекты, геология, атмосферные осадки, и позволяет определить возможные закономерности распространения и биогеографии отдельных групп микроорганизмов в локальном масштабе.

Ранее из микробных сообществ высокощелочных (рН 9.8-9.9) Белозерских озер были выделены алкалофильные бактерии, представляющие различные таксоны, многие из них были предложены как новые [Zhilina et al., 2004; Жилина и др., 2005; Жилина и др., 2009 а, b; Garnova et al., 2003; 2004]. В то же время не предпринимались попытки выделения алкалофильных актинобактерий, поэтому культивируемое разнообразие этой группы бактерий — деструкторов, обладающих весомым биотехнологическим потенциалом и способных к образованию биологически значимых соединений [Bennur et al. 2015; He et al. 2015; Zhao et al. 2016], совершенно не исследовано. Однако по результатам анализа микробного разнообразия методом высокопроизводительного секвенирования было выявлено, что их обилие в микробных сообществах осадков озер может достигать 4% общего микробного разнообразия [Зайцева и др., 2018]. Экологические условия в исследуемых озерах — высокая щелочность (рН до 10), доминирование карбонатов и гидрокарбонатов, значительные перепады минерализации — способствуют развитию алкалофильного микробного сообщества с возможным доминированием галофильных и галотолерантных бактерий.

Целью нашего исследования было выделение алкалофильных, галофильных и галотолерантных актинобактерий из донных осадков Белозерских озер и выявление возможных закономерностей распространения этой группы микроорганизмов в локальном масштабе.

Материалы и методы исследования

Озера Верхнее Белое (N 50º37'425" E 105º45'075") и Нижнее Белое (N 50º36'367" E105º45'801") расположены в южной части Боргойской степи (Джидинский район, Республика Бурятия). Территория характеризуется аридным климатом, низкими зимними температурами, большой сухостью воздуха и небольшим годовым количеством осадков (250–330 мм). Озерные бассейны не имеют стока и характеризуются смешанным типом водно-минерального питания, которое происходит за счет как атмосферных осадков, вымывающих соли из почв и горных пород водосбора, так родников и ручьев. Площадь и глубина озер варьируют в зависимости от температурных условий и количества осадков.

Физико-химические параметры придонной воды и осадков были определены непосредственно в местах отбора проб с использованием портативных приборов, макрокомпонентный состав придонной воды определяли в лабораторных условиях, как описано ранее [Зайцева и др., 2018].

Выделение культур микроорганизмов

Для выделения культур актинобактерий воздушно-сухие образцы осадков помещали в колбы со средой (1:9) следующего состава (г/л): NaCl — 7.5; KCl — 0.1; CaCl2 — 0.1; NaHCO3 — 0.2; Na4P2O7 — 1.0; дрожжевой экстракт — 60. Далее образцы перемешивали на шейкере со стеклянными бусинами в течение двух часов, при 28°С и 180 оборотах. Посев проводили методом предельных разведений на агаризованные среды (г/л): M1: пептон — 3.0, дрожжевой экстракт — 5.0, глицерин — 10.0, бетаин гидрохлорид — 1.64, C3H3NaO3 — 1.25; M2: глюкоза — 4.0, дрожжевой экстракт — 4.0, солодовый экстракт — 5.0, витамин B1 — 1 мл, солевой раствор — 1 мл; M3 (R2A, (BD)): дрожжевой экстракт — 0.50, протеозопептон — 0.50, казаминовые кислоты — 0.50, глюкоза — 0.50, растворимый крахмал — 0.50, K2HPO4 — 0.30, MgSO4 — 0.05, C3H3NaO3 — 0.30; M4 (SCA): растворимый крахмал — 10.0, казеин — 0.3, KNO3 — 2.0, MgSO4 — 0.5, K2HPO4 —1.0, (NH4)2SO4 — 2.0, CaCO3— 0.2, NaHCO3 — 2.0, солевой раствор — 1 мл. Солевой раствор (г/100 мл): FeSО4·7H2О — 0.1, MnCl2·4H2О — 0.1, ZnSО4·7H2О — 0.1. Доводили рН среды до 8–8.5. Каждую питательную среду готовили в трех вариантах: без добавления NaCl, c 2%-ной и 5%-ной концентрацией NaCl. Для подавления роста микромицетов и грамотрицательных бактерий в среды после автоклавирования добавляли налидиксовую кислоту (25 μг/мл), циклогексимид (40 μг/мл) и дихромат калия (50 μг/мл). Чашки Петри культивировали при 28–30°С в течение 3–7 недель. Для дальнейшего выделения и очистки культур актиномице-тов использовали среду ISP2 [Shirling and Gottlieb, 1966]. Рост полученных штаммов при различных значениях рН (6–11) определяли на агаризованной среде М4 (SCA) при 30°С и с добавлением NaCl в концентрации 2–5%. Определение устойчивости выделенных культур к различным концентрациям NaCl проводили на готовых ага-ризованных средах TSA (BD) и R2A (BD) с содержанием соли 2%, 5%, 10% и 15%.

Молекулярно-биологические методы

Выделение ДНК проводили согласно методу, описанному ранее [Zhou et al., 2010]. Для амплификации фрагментов гена 16S рРНК использовали универсальные праймеры 27F (5ʹ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3ʹ) and 1492R (5ʹ-GGTTACCTTGTTACGACTT-3ʹ) [Lane, 1991]. Температурно-временной профиль ПЦР был следующим: первый цикл – 95°С × 5 мин; последующие

35 циклов — 94°С × 1 мин, 55°С × 1 мин, 72°С × 2 мин; завершающий цикл — 72°С × 10 мин. Очистку и секвенирование продуктов ПЦР осуществляли в компании Sangon Biotech (Шанхай, КНР). Определение таксономической принадлежности полученных последовательностей гена 16S рРНК проводили с использованием инструментов сайта EzTaxon-e [Kim et al., 2012]. Соответствующие последовательности близкородственных видов были извлечены из базы данных GenBank с помощью сервера EzBioCloud. Множественное выравнивание сделано с использованием инструмента CLUSTALW в программном пакете MEGA версии 7.0 [Kumar et al., 2016]. Таксономическое положение определяли путем сравнения полученных последовательностей гена 16S pРНК длиной 850–900 н. п. с данными сервера EzTaxon-e (https:// www. и сайта LSPN (https:// www. , где перечислены все валидно опубликованные видовые названия прокариот. По итогам работы было выявлено 98–100%-ное сходство выделенных культур бактерий с ранее описанными типовыми штаммами. Филогенетические деревья построены с использованием метода максимального правдоподобия (maximum likelihood, ML) [Felsenstein, 1981] на основе генетических расстояний, которые рассчитывали с использованием двухпараметрической модели Кимуры [Kimura, 1980] с использованием MEGA 7.0. Для оценки устойчивости топологии полученных деревьев применяли метод bootstrap (1000 альтернативных деревьев) [Felsenstein, 1985]. На дендрограммах представлены значения выше 50%.

Результаты и обсуждение

Физико-химическая характеристика мест отбора проб

Пробы поверхностных осадков (5–10 см) были отобраны в августе 2018 г. Озера характеризовались мелководностью со средними глубинами до 2 м, соленостью (до 20.4 г/л в оз. Нижнее Белое и 34.7 г/л в оз. Верхнее Белое), сильнощелочным значением рН воды (9.75–9.8). В период исследований были отмечены максимальные значения минерализации воды за все годы наших исследований этих озер. Ранее минерализация воды в оз. Верхнее Белое не превышала 12–15 г/л, в оз. Нижнее Белое минерализация варьировала от 4.3 до 12 мг/л [Зайцева и др., 2018].

По гидрохимическим характеристикам озера являются типичными содовыми водоемами, с высоким щелочным рН (до 10), низкой концентрацией кальция и магния, с преобладанием в анионном составе карбонатов и гидрокарбонатов. По составу доминирующих ионов вода оз. Верхнее Белое отнесена к типу гидрокар-бонатной натриевой, вода оз. Нижнее Белое — к гидрокарбонатно-сульфатной, натриевой (табл. 1).

Характеристика выделенных штаммов актинобактерий

Из донных осадков содовых озер В. Белое и Н. Белое был выделен 61 штамм умеренно алкалофильных актинобактерий. Все культуры развивались в широком диапазоне рН (от 7 до 10), оптимальные значения рН для большинства изолятов составляли 8–8.5. Штаммы N45 и N271 оптимально росли при рН 8.5–9, а штаммы N47, N152 и N277 имели оптимум рН для роста 9–9.5. Все исследуемые штаммы принадлежали к филуму Actinobacteria , классу Actinobacteria . Штаммы, выделенные из осадков оз. Верхнее Белое, таксономически были соотнесены с 7 порядками: Corynebacteriales, Streptosporangiales, Micrococcales, Micromonosporales,

Streptomycetales, Streptosporangiales, Pseudonocardiales ; изоляты из оз. Нижнее Белое были близки с представителями 5 порядков: Micrococcales, Micromonospo-rales, Streptomycetales, Streptosporangiales, Pseudonocardiales .

Физико-химические параметры мест отбора проб

Таблица 1