Разнообразие микроорганизмов соляных пород Верхнекамского месторождения солей

Верхнекамское месторождение (ВКМС), расположенное на северо-востоке Пермского края, является одним из крупнейших в мире по запасам калийно-магниевой руды. Месторождение приурочено к пермской соляной толще, перекрытой соляно-мергелевыми и терригенно-карбонатными отложениями. Наиболее распространенными породами месторождения являются каменная соль, силь-винитовые и карналлитовые породы. В экстремальной геологической среде ВКМС представлены условия для выживания уникальных галофильных и галотолерантных микроорганизмов. Интерес к таким микроорганизмам обусловлен их высоким биотехнологическим потенциалом. Направления практического использования устойчивых к засолению микроорганизмов включают: получение осмопротекторных веществ, биополимеров и ферментов, активных при высокой осмолярности среды; применение в сельскохозяйственной и пищевой промыш- ленности; биоремедиации загрязненных экосистем. Кроме того, микроорганизмы данной группы являются модельными объектами при изучении эволюционных процессов, активации и стабилизации ферментов, структурно-функциональных взаимодействий белков в экстремальных условиях.

Микробные изоляты, а также нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК и функциональных генов были выделены из галитовых отложений в Европе, Восточной Азии, Северной и Южной Америке. Имеются сообщения о культивировании архей и бактерий из древних образцов галита и гипса (Vreeland et al., 2000; Stan-Lotter et al., 2002; Schubert et al., 2009; Saralov et al., 2013; León et al., 2024; Khoshnaw et al., 2025), секвенировании ДНК прокариот (Park et al., 2009; Gramain et al., 2011). Тем не менее микробные сообщества глубинных подземных экосистем, в том числе соляных пород, остаются крайне малоизученными.

Считается, что менее 1 % от реального разнообразия микроорганизмов может быть

Работа лицензирована в соответствии с CC BY 4.0. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите

описано с помощью культуральных методов (Равин и др., 2015). Поэтому для более глубокого изучения разнообразия микроорганизмов в природных местообитаниях в настоящее время все более востребованными становятся культурально-независимые подходы с использованием геномных технологий.

В данной работе представлены результаты исследований филогенетического разнообразия галофильных и/или галотолерантных микроорганизмов глубинных пород карналлита, каменной соли, мергеля ВКМС, полученных с применением микробиологических и молекулярно-генетических методов.

Материалы и методы

Для исследования были взяты образцы глубинных (70,5 - 411,5 м) пород карналлита, каменной соли, мергеля, отобранных из скважин Половодовского и Белопашнинско-го участков ВКМС. Образцы соляных пород были предоставлены сотрудниками Горного института УрО РАН (Пермь, Россия).

Перед микробиологическими и молекулярно-генетическими экспериментами проводили тщательную поверхностную стерилизацию отобранных образцов керна (соляных пород): погружение в 10М раствор NaOH (10 мин.), обработка 70 %-ным этанолом (5 мин.), выдерживание под УФ-светом (30 мин.) в ламинарном шкафу. Для экспериментов использовали пробы, полученные из глубины керна (4 - 7 см от поверхности).

Культуральные методы. Микроорганизмы выделяли методом накопительного культивирования с использованием ряда сред для выращивания галофильных бактерий и архей: ATCC 213 Halobacterium medium, JCM 168 и Раймонда (Korsakova et al., 2023; Пьянкова, Краева, 2024), в которых хлорид натрия присутствовал в высоких концентрациях (50-200 г/л). Устойчивость изолятов к различным концентрациям соли оценивали по появлению и размеру колоний при росте на агаризованных средах (перечисленных выше): без добавления NaCl и с содержанием NaCl от 10 до 270 г/л. Способность штаммов разлагать органические соединения оценивали путем культивирования в жидких минеральных средах с добавлением нафталина, бифенила, орто-фталевой, бензойной, про-токатеховой, салициловой кислот.

Молекулярно-генетические методы . Выделение ДНК из полученных накопительных культур или непосредственно из поверхностно стерилизованного образца соли проводили с применением набора реактивов Fast DNA spin kit for soil (MP Biomedicals, Франция).

Для идентификации выделенных бактерий и архей проводили амплификацию генов 16S рРНК с использованием универсальных бактериальных 27F/1492R и архейных праймеров 109F/958R (Korsakova et al., 2023).

Для установления в образцах соляных пород разнообразия микроорганизмов (в том числе некультивируемых) были получены библиотеки клонов бактериальных и ар-хейных генов 16S рРНК (Пьянкова и др., 2021; Korsakova et al., 2023).

Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов бактериальных и ар-хейных генов 16 рРНК проводили на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 3500XL (Applied Biosystems, США). Филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводился с использованием программ Sequence Scanner v. 2.0., MEGA 7.0 (http://www.megasoftware.n et). Поиск гомологичных последовательностей осуществлялся с использованием баз данных EzBioCloud и GenBank (http:/.

Результаты исследований

В результате проведенных исследований из образцов породы карналлита , отобранных с различной глубины (203,9 - 308,8 м) разработок ВКМС, были выделены бактерии разных таксономических групп (табл. 1). На основании секвенирования и последующего биоинформационного анализа фрагмента гена 16S рРНК установлено, что исследуемые штаммы были идентифицированы как представители классов Actinomycetes (семейство Micrococcaceae ) (Ястребова, Пьянкова, 2021; Пьянкова, Краева, 2024), Bacilli (семейство Bacillaceae ) (Карташова и др., 2016; Пьянкова, Краева, 2024).

Таблица 1. Культивируемые бактерии из соляных пород ВКМС

Глубина (м)	Штамм	Ближайший типовой штамм по гену 16S рРНК (% сходства)	Ссылка
Карналлит
203,9	KN25	Virgibacillus salinus CGMCC 1,10449T (99,74 %)	(Пьянкова, Краева, 2024)
254,2	YKS43-1a	Bacillus safensis FO-36bT (100 %)	(Карташова и др., 2016)
	43-1	Micrococcus luteus NCTC 2665T (99,59 %)	(Ястребова, Пьянкова, 2021)
308,8	KN12bel	Metabacillus litoralis SW-211T (100 %)	(Пьянкова, Краева, 2024)
	KN12or	Kocuria rosea DSM 20447T (99,62 %)	(Пьянкова, Краева, 2024)
Каменная соль
239,7	YKS38R	Kocuria rhizophila DSM 11926T (99,86 %)	(Карташова и др., 2016)
	38-1	Micrococcus aloeverae AE-6T (99,93 %)	(Пьянкова и др., 2019; Ястребова, Пьянкова, 2021)
	38-5	Streptomyces coelicoflavus NBRC 15399T (100 %)	(Пьянкова и др., 2019; Ястребова, Пьянкова, 2021)
372,2	69-6	Micrococcus luteus NCTC 2665T (99,13 %)	(Ястребова, Пьянкова, 2021)
411,5	YKS72R1	Dietzia cinnamea IMMIB RIV-399T (99,50 %)	(Карташова и др., 2016)
	72-1	Micrococcus luteus NCTC 2665T (100 %)	(Ястребова, Пьянкова, 2021)

Выделенные бактерии являются галотоле-рантными организмами, растут на средах как без добавления соли, так и при повышенных концентрациях NaCl (70-150 г/л). Штамм Virgibacillus sp. KN25 способен к росту при 200 г/л NaCl (Пьянкова, Краева, 2024). Интересен факт, что выделенные бактерии являются деструкторами ароматических соединений (табл. 2). Так, Bacillus sp. YKS43-1a способен использовать в качестве единственного источника углерода и энергии нафталин, бифенил, орто-фталевую, бензойную и салициловую кислоты (Карташова и др., 2016), Micrococcus sp. 43-1 - бензойную кислоту (Ястребова, Пьянкова, 2021), а штамм Kocuria sp. KN12or - бензойную и протокатеховую кислоты (Пьянкова, Краева, 2024), являющиеся продуктами метаболизма многих поли(моно)ароматических соединений (табл. 2). У Kocuria sp. KN12or выявлен ген benA, кодирующий бензоат 1,2-диоксигеназу - ключевой фермент деструкции бензоата. Секвенирование и последующий анализ фрагмента гена benA показал наибольшее сходство (98,93 %) с benA- генами представителей рода Kocuria, изолированными из морской воды (Китай) (Пьянкова, Краева, 2024).

Из образцов каменной соли были выделены бактерии класса Actinomycetes , близкородственные родам Micrococcus, Streptomyces и Dietzia (табл. 1) (Карташова и др., 2016; Пьянкова и др., 2019; Ястребова, Пьянкова, 2021). Исследуемые штаммы являются галотолерантными организмами, Micrococcus sp. 38-1, 69-6, 72-1 способны расти в присутствии NaCl до 70 г/л (Ястребова, Пьянкова, 2021), а штаммы Kocuria sp.YKS38R и Dietzia sp.YKS72R1 - до 150 г/л (Карташова и др., 2016). Проверка способности исследуемых изолятов к росту на ароматических субстратах показала, что штаммы рода Micrococcus могут использовать бензойную кислоту в качестве единственного источника углерода и энергии (Ястребова, Пьянкова, 2021), а штамм Kocuria sp. YKS38R - нафталин, бифенил, орто -фталевую, бензойную и салициловую кислоты (табл. 2).

Таблица 2. Бактериальные штаммы из соляных пород ВКМС, способные использовать мо-но(поли)ароматические соединения в качестве единственного источника углерода и энергии

Штамм \	Ароматические соединения           \	Ссылка
Карналлит
Bacillus sp. YKS43-1a	нафталин, бифенил, орто -фталевая, бензойная и салициловая кислоты	(Карташова и др., 2016)
Micrococcus sp. 43-1	бензойная кислота	(Ястребова, Пьянкова, 2021)
Kocuria sp. KN12or	бензойная и протокатеховая кислоты	(Пьянкова, Краева, 2024)
Каменная соль
Kocuria sp. YKS38R	нафталин, бифенил, орто -фталевая, бензойная и салициловая кислоты	(Карташова и др., 2016)
Micrococcus sp. 38-1	бензойная кислота	(Ястребова, Пьянкова, 2021)
Micrococcus sp. 69-6	бензойная кислота	(Ястребова, Пьянкова, 2021)
Micrococcus sp. 72-1	бензойная кислота	(Ястребова, Пьянкова, 2021)

В образце каменной соли (с глубины 239,7 м) было исследовано разнообразие бактерий и архей с использованием молекулярно-генетических методов (Пьянкова и др., 2019; Пьянкова и др., 2021). Из накопительной культуры, полученной при культивировании образца соли в жидкой среде ATCC 213 Halobacterium medium, была выделена тотальная ДНК, на матрице которой в результате клонирования была создана библиотека бактериальных генов 16S рРНК. Полученные последовательности генов 16S рРНК были секвенированы и по результатам проведенного биоинформационного анализа подразделены на 9 групп (операционных таксономических единиц, OTЕ), которые соответствовали филумам Pseudomonadota и Actinomycetota. Филум Pseudomonadota включал 7 филотипов, относящихся к классам Alpha- Beta- и Gammaproteobacteria (рис. 1). Большая часть клонов (61,74 % от всех бактериальных клонов) представляли род Pseudomonas (класс Gammaproteobacteria). К классу Gammaproteobacteria также были отнесены клоны, близкородственные представителям родов Serratia и Shigella (семейство Enterobacteriaceae) и некультивируемым бактериальным клонам, выявленным в различных природных источниках, таких как арктические донные осадки (GenBank FJ849472), микробиом северного калифор- нийского морского льва (GenBank JQ207675), заболоченная почва в Китае (GenBank KR148991). Обнаружены филотипы, проявляющие наибольшее сходство с представителями ризосферных бактерий родов Ralstonia и Phyllobacterium. Среди филу-ма Actinomycetota выявлены представители класса Actinobacteria, около 20 % клонов от общего их числа содержали последовательности генов 16S рРНК, сходные на уровне 99,72 % с Rhodococcus qingshengii JCM15477T (рис. 1).

Анализ полученных последовательностей генов 16S рРНК архейных клонов из образца каменной соли показал, что они разделяются на три ОТЕ и проявляют наибольшее сходство с представителями филумов Halobacte-riota, Thermoplasmatota и Candidatus Thaumarchaeota (табл. 3). Исследуемые клоны по гену 16S рРНК сходны на уровне 99,35 - 99,60 % с некультивируемыми ар-хейными клонами, обнаруженными в железомарганцевом месторождении (США) (GenBank JN820168) и почве (Шотландия) (GenBank HQ285262). В то же время исследуемые архейные клоны проявляют низкий уровень сходства (72,93 – 93,63 %) с типовыми видами родов Geoglobus , Thermococcus , Nitrosopumilus (табл. 3).

Изучено разнообразие некультивируемых форм бактерий и архей в образце мергеля, отобранного с глубины 70,5 м, с использова- нием молекулярно-генетических методов. Полученные бактериальные клоны (последовательности генов 16S рРНК) были объединены в 11 ОТЕ, представляющих филумы Pseudomonadota, Actinomycetota и Acidobacteriota (Korsakova et al., 2023). Большинство клонов (44,19 %) принадлежало к представителям рода Pseudomonas (класс Gammaproteobacteria) (рис. 2). Вторая по величине группа клонов этого класса включала последовательности, сходные на уровне 99,63 % с таковыми штамма Serratia grimesii NBRC 13537T. Идентифицированы ОТЕ, близкородственные представителям класса Betaproteobacteria (роды Ralstonia и Variovorax) и класса Alphaproteobacteria (род Phyllobacterium). В пределах филума Actinomycetota (23,26 % от общего числа бактериальных клонов) группа клонов класса Actinobacteria (11,63 %) представлена единственным родом Rhodococcus и проявляет 100 % сходство (по гену 16S рРНК) со штаммом Rhodococcus erythropolis NBRC 15567T (рис. 2).

Serratiaplymuthica ISR 2 (KX035070)

Клон SedNCB15 (FJS49472)

Клон 92BA (MH410140)

' - L Serratia grimesii NBRC 135377 (BCTT01000034)

1M L Клон 77BA (MH410138), Клон 38ВА (МН410130). Клон 119ВА (МН410144)

Клон 53BA (MH410135), Клон 100BA (MH410141)

Shigella sonnei CECT 4887¹ (FR870445

W Shigella sp. CH-42 (KR148991)

Клон SlnRc 02CSL4aFA 130207675)

Клон ИВА (MH410127)

Клон 121BA (MH410145), Клон 7BA (MH410126)

Pseudomonas edaphica RD25^T (LC272923)

Pseudomonas azotoformans OLsAul (MF598585)

Клон Sl-037 (KF182781)

-Клон S7BA (MH410139)

-Клон НОВА (MH410143), Клон 6ВА (МН399229)

Gammaproteobacteria

Betaproteobacteria

Клон 101JB (KY968992)

ЮС Клон JR42 (KC207921)

Phyllobacterium loti S658^T (KC577468)

Клон 71BA (MH410137)

93l Chelativorans multitrophicus DSM 9103^T (EF45 7243)

Chelativorans multitrophicus LPM-410 (FJ167675)

Клон 12BA (КШ410128)

Alphaproteobacteria

JO

- Клон SIHA746 N9D0 16S В (LN568107)

; — Клон 66BA (MH410136)

Mesorhizobium alhagi CCNWXJ12-2¹ (AHAMO1OO0052)

Mesorhizobium sp. LCD31 (MN59602)

Клон Mesorhizobium sp. T15 (LC070335)

Rhodococcus sp. voya40thlll (MT626151)

Rhodococcus degradans CsDWL-128 (MT415127)

Rhodococcus qingshengii JCM15477^T (LRKJ01000016)

Клон 25BA (MH410129), Клон 50BA (MH410132). Клон 52BA (MH410134)

---KjiohoNFOI (EF034304)

Клон 51BA (MH410133)

99 Demequina aestuarii NBRC 106260^T (BBRD01000001) '-Demequina sp. EGI80499 (KT734858)

Actinobacteria

0.02

Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное с использованием метода neighbor-joining, показывающее положение исследуемых бактериальных клонов, полученных из образца каменной соли (с глубины 239,7 м), основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК. Номера в базе данных GenBank указаны в скобках. Клоны с идентичными генами 16S рРНК перечислены через запятую (Пьянкова и др., 2021)

Таблица 3. Архейные клоны (гены 16S рРНК) из соляных пород ВКМС

Глубина (м)	Клон	Ближайший типовой штамм по гену 16S рРНК (% сходства)	Ссылка
Каменная соль
239,7	53AR	Geoglobus acetivorans SBH6T (72,93 %)	Данная работа
	54AR	Thermococcus hydrothermalis AL662T (76,32 %)
	60AR	Nitrosopumilus ureiphilus PS0T (93,63 %)
Мергель
70,5	27J, 31J, 28J	Nitrosopumilus ureiphilus PS0T (92,88, 92,39, 93,44 %)	(Korsakova et al., 2023)

6s

100 “65

Клон 95JB [KY964066]

KnoHnbtl88d01 [EU5 35031]

Клон 92JB [KY963995]

Клон nbt97d05 [EU539032]

Pseudomonas brenneri CFML 97-391^T [AF268968]

гКлон 98JB [KY964326]

Tool serratia grimesii NBRC 13537^T [BCTTO1000034]

Ralstonia pickettii ATCC 27511^T [JOVLOl 000020]

Клон 104JB [KY964402]

Variovorax boronicumulans BAM48^T [AB300597]

юо Клон MTWL201309-98 [KX509638]

7 7 Клон 96JB [KY964411]

₁₀₀| Клон 101JB [KY968992]

~'ⁱ Phyllobacterium trifol it PETP02¹ [AY786O80]

7^ _r Mesorhizobium alhagi CCNWXJ12-2^T [АНАМ01000052]

₉₁ i- Mesorhizobium chacoense PR5^T [AJ278249]

K1OHPW1J95 [GQ263338]

Gammaproteobacteria

Betapro teo bacteria

Alphaproteobacteria

1001 Клон 67JB [KY963934]

_1Q0| Клон 82JB [KY964287]

Aciinobacteria

' Rhodococcus erythropolis NBRC 15567^T [BCRM01000055]

^Клон HDB_SIPP425 [HM187226]

Клон 29JB [KY963935]

— Gaiella occulta 72-233- [JF423906]

---Solirubrobacter ginsenosidimutans BXN5-15^T [EU332825]

Rubrobacteria

100 _

Клон 97JB [KY964440]

Клон bacBiof_0639 [KC605428]

г Клонр7к!3ок [FJ478513]

Tool-Клон 63JB [KY963936]

Acidobacteria

------Nitrososphaera viennensis EN76^T [CPO07536]

----Nitrosopumilus maritimus SCM1^T [NR 102913]

___। Клон A06 [JX311851]

Tool клон 27J [KY357357]

Thaumarchaeota

I---------------------------------------------------1 0.05

Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное с использованием метода neighbor-joining, на основе последовательностей гена 16S рРНК бактерий и архей, полученных из образцов мергеля, и гомологичных последовательностей из баз данных NCBI и EzBioCloud. В скобках указаны номера последовательностей в базах данных (Korsakova et al., 2023)

Анализ последовательностей генов 16S рРНК архейных клонов показал, что они проявляют наибольшее сходство с археями филума Candidatus Thaumarchaeota и сходны на уровне 99,76 - 100 % с некультивируемым архейным клоном A06 (GenBank JX311851), выделенным из грунтовых вод пермского периода (США) (рис. 2). Типовой штамм Nitrosopumilus ureiphilus PS0 ^T , наиболее близкий по гену 16S рРНК (уровень сходства 92 - 93 %) исследуемым клонам, был изолирован из прибрежного морского осадка (США) (GenBank KF957664) (табл. 3).

Заключение

С использованием микробиологических и молекулярно-генетических методов выяснено, что в глубинных образцах соляных пород (карналлита, каменной соли, мергеля) ВКМС присутствует большое разнообразие гало-фильных/галотолерантных бактерий филу-мов Pseudomonadota , Actinomycetota , Thermodesulfobiota , Acidobacteriota , а также экс-тремофильных архей филумов Halobacteriota , Thermoplasmatota , Candidatus Thaumarchaeota. Обнаружены микроорганизмы, демонстрирующие низкий уровень сходства по гену 16S рРНК с типовыми штаммами известных видов бактерий, что указывает на присутствие в солях (отложениях пермского периода) новых, не описанных ранее таксонов микроорганизмов. У выделенных из соляных пород бактерий выявлена способность разлагать мо-но(поли)ароматические соединения (в том числе нафталин, бифенил, бензойную кислоту), являющиеся загрязнителями окружающей среды. В перспективе исследуемые бактерии могут быть использованы при разработке биотехнологий очистки загрязнен-ных/засоленных экосистем. Планируется дальнейшее исследование микроорганизмов, обнаруженных в подземных залежах солей Верхнекамского месторождения.

Исследования выполнены в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (124020500028–4). В работе использовано оборудование Центра коллективного пользования «Исследования материалов и вещества» ПФИЦ УрО РАН.