Разработка и валидация методик хроматографического определения для идентификации, количественной оценки препаратов карбоновых кислот

Выбор элюента в жидкостной адсорбционной хроматографии играет более значимую роль, чем выбор неподвижной фазы. Растворитель напрямую участвует в самом процессе разделения, в связи с чем, изменяя природу растворителей подвижной фазы, возможно в широких пределах изменять удерживание и селективность разделения на одних и тех же адсорбентах. Для получения оптимальных значений R f экспериментально подбирают растворители с определенной элюирующей способностью. Самый простой способ получения подвижной фазы с любой элюирующей способностью состоит в смешивании двух растворителей с разной полярностью [1]. Основной целью исследования была разработка унифицированного метода идентификации для некоторых лекарственных препаратов – производных карбоновых кислот. В качестве объекта исследования нами были выбраны кислота янтарная, фумаровая, никотиновая и глутаминовая. В ходе исследования изучена подвижность веществ в растворителях с различной элюирующей способностью. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Подвижность некоторых производных карбоновых кислот в растворителях с различной элюирующей способностью

Растворитель	5 я ° о у 2 К У я 8 Я О	8 я я 8 ся м	5 я S ^ 5 е	о я я н	§ я 2 н я о я к
Бензол	2,3	0,05	0	0	0
Толуол	2,3	0	0	0	0
Диэтиловый эфир	4,2	0,45	0,19	0,01	0,88
Хлороформ	4,8	0	0	0,03	0,03
Этилацетат	6,0	0	0,08	0,78	0,16
Кислота ледяная уксусная	6,2	0,84	-	-	0,6
Пиридин	12,9	0,05	0,03	0	0,48
Изоамиловый спирт	15,2	0,65	0	0,2	0,13
Аммиак	16,5	0,98	0,98	0,98	0,96
Бутанол	17,8	0,7	0,05	0,03	0,12
Ацетон	20,7	0,8	0,15	0	0,09
Изопропанол	21,8	0	0	0	0,15
Этанол	24,5	0,8	0,38	-	0,8
ДМФА	36,7	0,95	0	-	-
Ацетонитрил	37,5	0,74	0,2	0	0,073
Вода	78,5	0,96	0,98	0,99	0,99

Величина Rf 0,4 – 0,7 наблюдалась при использовании растворителей с величиной диэлектрической проницаемости не более 20. На основании полученных данных предложены бинарные системы растворителей с рассчитанной элюирующей способностью. Расчет проводили по формуле [3]:

, где

– мольная доля более сильного растворителя;

– значения для чистых растворителей;

(≈Ax) – площадь, необходимая для размещения молекулы растворителя B на поверхности;

a - параметр активности;

Параметр Nb рассчитывали по формуле:

, где

∨ _а

- величины, обратные мольной доле.

Экспериментально установлено, что наиболее эффективными для идентификации изучаемых веществ являются смеси растворителей с величиной диэлектрической проницаемости равной 0,6. В дальнейшем, для выбора оптимальных соотношений растворителей, формулу преобразовали:

¹ (IQ ® / п ⁽ Е а ^- Е в ) _- 1)

∨ _в

А

В

(1Q

а п ( Е _Q - а пЕ а )

∨

а

^- 1)

∨ _в

Для более эффективной работы, была написана программа на основе VisualBasic. Электронная таблица преобразуется посредством объектноориентированной модели кода и данных, которые мгновенно обрабатываются. Таблица становится интерфейсом кода, позволяя легко работать изменять его и управлять расчётами. Смешением двух растворителей с разной полярностью можно приготовить систему с любой элюирующей способностью. На основании полученных элюотропных рядов были предложены различные бинарные системы растворителей, из которых оптимальными свойствами обладала система этилацетат – спирт этиловый. Хроматографирование проводили в данной бинарной системе растворителей с различным соотношением более полярного растворителя (спирта этилового), от 10 до 90% по объему, результаты определения приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Определение подвижности кислоты янтарной в системе растворителей этилацетат - спирт этиловый

Соотношение растворителей этилацетат: спирт этиловый	Элюирующая способность системы	Величина R f кислоты янтарной
		Кислота никотиновая	Кислота глутаминовая	Кислота фумаровая	Кислота янтарная
9:1	0,779	0,345	0,730	0,223	0,764
8:2	0,815	0,405	0,734	0,307	0,802
7:3	0,833	0,412	0, 740	0,207	0,805
6:4	0,850	0,388	0,738	0,212	0,812
5:5	0,855	0,371	0,741	0	0,815
4:6	0,862	0,367	Хвост	0	0,823
3:7	0,868	Хвост	Хвост	0	0,823
2:8	0,872	Хвост	Хвост	0	0,834
1:9	0,877	Хвост	Хвост	0	0,830
0:10	0,88	0	Хвост	0	0,843
10:0	0,48	0	Хвост	0	0

Доказано, что введение более полярного для кислоты янтарной вызывает сначала резкое увеличение элюирующей способности системы, но дальнейшее возрастание его концентрации практически не изменяет свойств системы, носит асимптотический характер, что согласуется с литературными данными. Крутизна начального подъема экспоненциальной кривой тем больше, чем больше различия в полярности обоих растворителей. Кислота фумаровая при соотношении растворителей 1:1 и с дальнейшим увеличением концентрации спирта этилового остается на старте, а для кислоты никотиновой и глутаминовой происходит неполный отрыв вещества от линии старта.

Детектирование осуществляли 0,1% спиртовым раствором метилового красного, а для проявления кислоты глутаминовой использовали раствор 0,1% нингидрина в спирте этиловом с дальнейшим нагреванием на плитке [2].

Для дальнейшей модификации предложенной методики мы проводили исследование по влиянию процесса импрегнирования пластинок поверхностно - активными веществами. Для этого целесообразно использовать катионоактивные четвертичные аммониевые основания, в частности цетилпиридиния хлорид. Известно, что изотерма адсорбции катионных ПАВ имеет два плато: первое характеризует нейтрализацию заряда поверхности силикагеля, при этом мономеры катионного ПАВ замещают адсорбированные молекулы воды, а второе отвечает за образование гемимицелл на поверхности за счет гидрофобных взаимодействий между хвостами мономеров поверхностно-активных веществ [4]. Мицелярные свойства цетилпиридиния хлорида (ЦПХ) подходят для использования в хроматографии: точка Крафта (температура, выше которой возможно мицеллообразование) составляет 19,5°С, а критическая концентрация мицеллообразования 9,0Л0-4 моль/л. В связи с этим мы предложили проводить идентификацию наших производных карбоновых кислот следующим образом. Хроматографическую пластинку «Сорбфил» помещали в камеру с раствором цетилпиридиния хлорида 0,001 %. После того, как фронт растворителей достигнет линии финиша, пластинку вынимали, высушивали в течение 2 часов, а затем на линию старта наносили по 5 мкл 0,1% водно-спиртовых растворов (1:1) кислоты фумаровой, янтарной, никотиновой, глутаминовой и хроматографировали после высушивания восходящим методом в камере, предварительно насыщенной системой растворителей этилацетат – спирт этиловый (8:2). Затем пластинку вынимали, высушивали и детектировали. На хроматограмме наблюдались четкие пятна овальной формы.