Разработка концепции производства снеков из пшеницы с элиминицией глютена биокаталитическим методом

Производство и потребление снеков – стремительно развивающееся направление пищевой промышленности, обусловленное глобальными изменениями в структуре и привычках приема пищи. Экструдирование как метод переработки сельхозсырья, используемый в производстве готовых завтраков, детского и диетического питания, соленых закусок, обеспечивает возможность производства снеков из относительно недорогих ингредиентов на основе злаков. Кроме того, технология обладает большим потенциалом управления пищевой ценностью подобных продуктов на основе методов пищевой комбинаторики. Ингредиентной основой для таких продуктов являются зерно пшеницы, ржи, ячменя, овса и продуктов их переработки. Серьезным вызовом для медицинского сообщества и пищевой науки является преодоление проблем со здоровьем, вызываемых при употреблении продуктов с этими злаками ввиду аллергических реакций, опосредованных иммуноглобулином Е (IgЕ) или не-IgЕ [1, 2]. Причиной является группа запасающих белков, получивших общее определение глютен, включающий объединенные глиадиновую и глютениновую фракции. Кроме целиакии фракции глютена вызывают неглютеновую чуствитель-ность к глютену, герпетиформный дерматит, атаксию глютена [3]. Показано, что распространенность аутоимунных заболеваний, среди которых были инсулинозависимый сахарный диабет, аутоиммунные заболевания щитовидной железы, болезнь Аддисона, первичный синдром Шегрена, псориаз, была значимо выше в группе болеющих целиакией [4]. Фракции глютена глиадины и глютенины характеризуются высоким содержанием пролина (около 15%), глютамина (около 35%), и гидрофобных аминокислот (около 19%) [5]. В глиадине, молекулярная масса белков которого находится в диапазоне 28000– 55000, выделяют четыре фракции: α, β, γ и ω [6], при этом основным инициатором иммунного ответа является 33-мерный полипептид, устойчивый к гидролизу желудочными, панкреатитными и кишечными протеазами [5]. Устойчивость фракций глютена к гидролизу этими протеазами определяется наличием структурных доменов; которые содержат уникальные повторяющиеся последовательности аминокислот глютамина и пролина.

Действенным и общепринятым способом преодоления алиментарных заболеваний, связанных с потреблением глютенсодержащих злаков, является переход и поддержание на протяженности всей жизни строгой безглютеновой диеты [7, 8]. Проблемой для традиционных и инновационных безглютеновых продуктов является контаминация безглютенового сырья глютеновым при хранении в силосах и на производственных линиях. При этом строгий контроль на всех стадиях производства безглютеновых злаков от подготовки семенного фонда и выращивания до хранения, переработки и упаковки значительно увеличивает стоимость безглюте-новых продуктов для потребителя.

Альтернативным направлением элиминации глютена, является деструкция белков пшеницы и других глютенсодержащих злаков биотехнологическими методами, нацеленными на гидролиз пролиновых и глютаминовых связей [9]. Исследование гидролиза фракций белка пшеницы при приготовлении теста с использованием заквасок молочнокислых бактерий Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus brevis, Lactobacillus sanfranciscensis и Lactobacillus hilgardii показало [10] увеличение содержания свободных аминокислот, особенно пролина, глутаминовой и аспарагиновой кислот. Показана возможность использования пролилэндопептидазы, синтезируемой Flavobacterium meningosepticum , как бикатализатора для гидролиза глютена, которая снизила количество потенциально имунно-стимулирующих пептидов, ослабляя тем самым их токсический эффект [11]. Кроме того, свою эффективность деструкции пролинсодержащих пептидов с перспективой их использования в оральной энзимотерапии показали пролилолигопептидазы из Flavobacterium meningosepticum, Sphingomonas capsulate и Myxococcus Xanthus [9].

Одним из способов физико-химической модификации глютена и его подготовки к эффективному гидролизу является варочная экструзия, во время которой белки разворачиваются, перестраиваются, денатурируются, вторичные, третичные и четверичные структуры претерпевают значимые изменения [12, 13]. Исследование влияния экструзии на гидролиз глютена показало увеличение степени биокатализа на 19,2% [13], повысилось содержание свободных и общих аминокислот и пептидов с молекулярной массой ниже 5 кДа.

Таким образом, процессы биокатализа и экструзии имеют большой потенциал в модификации молекулярной структуры фракций глютенинов и глиадинов пшеницы. Перспективным является объединение этих процессов в технологии получения снеков с использованием зерна пшеницы и деструкцией глютена. Варочная экструзия в таких технологиях может использоваться на двух стадиях, предподго-товка пшеницы и других злаков перед ферментативным гидролизом и для получения снеков из прогидролизованного зерна, где приемлемые потребителем сенсорные атрибуты продукта (текстура, твердость, пористость) будут формироваться за счет экструдированных биополимеров крахмала пшеницы.

Целью настоящего исследования является изучение влияние различных ферментных систем и процесса экструзии на потенциал гидролиза белков пшеницы, результаты которого могут быть положены в основу разработки технологии снеков из пшеницы с элиминацией глютена.

Материалы и методы

Объектом исследования являлись зерно пшеницы, гидролизаты пшеницы, процессы экструзии и биокатализа.

Таблица 1.

Характеристика ферментных препаратов

Table 1.

Characteristics of the enzyme preparations

Ферментный препарат Enzyme	Продуцент Strain producer	Состав ферментного комплекса, ед./г (ед./см3) (ферментная активность) Specific enzymes activity, Units per 1 g of preparations (enzyme activity)
		в if р	s о и	h S о р й О	S	g S 1
КФПА (комплексный ферментный препарат Амилопротооризин, (порошок) CFPA (powder)	Aspergillus oryzae	600	800	–	50	–
Протоферм FP (ультраконцентрат (УК) Protoferm FP (ultraconcentrate (UC)	Aspergillus niger	900	–	–	–	–
Флавозим (УК) | Flavourzyme (UC)	Aspergillus oryzae	500	–	–	–	–
Визкоферм (УК) | Viscoferm (UC)	Aspergillus niger	–	–	–	1000	1100
Термамил (УК) | Termamyl (UC)	Bacillus subtiliis	–	900	200	–	–

Активность ферментных препаратов определяли по ГОСТ 34430–2018 «Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения протеолитической активности», ГОСТ Р 55302–2012 «Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения ксиланазной активности», ГОСТ Р 55293–2012 «Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения целлюлазной активности», ГОСТ 34440–2018 «Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения амилолитической активности». Ферментативную обработку образцов пшеницы и экструдатов осуществляли ферментативными системами гидролитического действия в подобранных ранее условиях: в течение 2 ч при 50 °С при рН 5,5; гидромодуль суспензии 1:3.

Для определения фракционного состава белков исходного сырья и их ферментолизатов использовали метод электрофореза в полиакриламидном геле с использованием Mini-Protean Tetra System (BioRad, USA).

Результаты и обсуждение

Проведено сравнение гидролиза неэкструди-рованного и проэкструдированного помола пшеницы различными ферментными системами (ФС), в состав которых входили ферменты различной специфичности и механизма действия. Так, например, для протеаз грибного происхождения характерно наряду с протеиназами, катализирующими гидролиз внутренних пептидных связей с образованием пептидов с различной молекулярной массой, наличие пептидаз – ферментов экзо-действия, расщепляющих полипептиды с высвобождением отдельных аминокислот или дипептидов. ФП КФПА и Протоферм, в основном, представлены протеиназами и петидазами эндодействия: металлозависимой нейтральной, сериновой и цистеиновой протеиназами. ФС-1 и ФС-2 содержали помимо ферментов протеолитического действия, ферменты амилолитического и гемицел-люлазного действия, позволяющие деструктуи-ровать крахмал и полисахариды зерна.

На рисунке 1 представлены электрофореграммы прогидролизованных белков пшеницы и экструдата пшеницы. Аллергенные белки пшеницы имеют молекулярную массу в диапазоне от 30 до 100 кДа. Молекулярная масса белковых фракций глиадина составляет от 30 до 60 кДа, а для глютелина – от 60 до 100 кДа.

М К 1м 2м Зм 4м 1 э 2э Зэ 4э

• 1    м-4 м – Мука пшеничная цельнозерновая, прогидро-лизованная с использованием ферментов: 1 м – КФПА;

• 2    м – Флавозим; 3 м – Протоферм FP + Термамил + Визкоферм (ФС-1); 4 м – КФПА + Протоферм + Термамил + Визкоферм (ФС-2); 1э-4э – Экструдаты пшеницы, прогидролизованные с использованием ферментов: 1э – КФПА; 2э – Флавозим; 3э – Протоферм FP + Термамил + Визкоферм (ФС-1); 4э – КФПА + Протоферм + Термамил + Визкоферм (ФС-2)

• 1    m-4 m – Whole grain wheat flour, hydrolyzed using enzymes: 1 m – KFPA; 2 m – Flavozyme; 3 m – Protoferm FP + Termamil + Vizkoferm (FS 1); 4 m – KFPA + Protoferm + Termamil + Vizkoferm (FS 2); 1e 4e – Extrudates of wheat, hydrolyzed using enzymes: 1e – KFPA; 2e – Flavozyme; 3e – Protoferm FP + Termamil + Vizkoferm (FS 1); 4e – KFPA + Protoferm + Termamil + Vizkoferm (FS 2)

Рисунок 1. Электрофореграмма прогидролизованных белков пшеницы и ее экструдатов

Figure 1. Electrophoregram of hydrolyzed extruded and non-extruded wheat proteins

По отсутствию на электрофореграмме проэкструдированных образцов белковых полос с молекулярной массой, соответствующей глиадину и глютенину, установлено, что экструзия как фактор модификации белка значительно влияет на протеолиз белков пшеницы всеми используемыми в эксперименте ферментными системами.

Показано, что наиболее эффективный гидролиз обеспечило использование ферментного комплекса КФПА, в том числе при биоконверсии непроэкструдированной пшеницы.

Таким образом подтверждено расщепление высокомолекулярных белковых фракций пшеницы и экструдата за счет наличия в составе ферментного комплекса КФПА эндопептидазы, обеспечивающей максимальный биокатализ белковых фракций до свободных аминокислот с максимальным высвобождением фракции пролина, отвечающей за аллергенность зерна.

Полученные результаты коррелируют с ранее полученными данными по изучению влияния различных экспериментальных ферментных систем, синтезируемых Asp. оryzae, Asp. foetidus, Bacillus subtilis , а также коммерческой протеазы, синтезируемой Bacillus licheniformis , и папаина из Papaya latex на степень деструкции белков тритикале [14]. Наиболее эффективной была обработка комплексом ферментов, синтезируемых Asp. oryzae . Степень гидролиза белков составила около 90%, около 50% от общего количества аминокислот перешло в свободное состояние. Содержание пролина в свободной форме в хлебе, полученном с использованием гидролизованного тритикале увеличилось с 0,01 до 1,04 г. в 100 г. сухих веществ хлеба. Увеличилось содержание в свободной форме метионина, валина, изолейцина, лейцина, фенилаланина, треонина, триптофана и лизина.

Использование экструзии в данном исследовании позволило значительно снизить молеку-ляную массу продуктов гидролиза экструдатов пшеницы. Поэтому интеграция процесса экструзии в процесс биоконверсии глютена несет определенные перспективы для его элиминации в продуктах питания, в том числе готовых к употреблению зерновых снеках. Варочная экструзия в таких технологиях может использоваться на двух стадиях, предподготовка пшеницы перед ферментативным гидролизом и для получения снеков из прогидролизованного зерна, где приемлемые потребителем сенсорные атрибуты продукта (текстура, твердость, пористость) будут формироваться за счет экструдированных биополимеров крахмала пшеницы.

Необходимо отметить, что важной проблемой для использования гидролизатов в последующем экструдировании является высокое влагосодержание в прогидролизованных средах, что делает невозможным их прямую экструзионную переработку. Введение дополнительных технологических стадий обезвоживания или подсушки значительно удорожает процесс, поэтому наиболее оптимальным является смешивание и внесении в рецептуру для экструдирова-ния безглютеновых злаков и бобовых. Также возможно использование системы отбора пара в процессе экструдирования, которая позволит значительно снизить количество воды в камере перед формующей фильерой [15].

Технологический процесс получения готовых к употреблению зерновых снеков в данном случае должен состоять из стадий экструзии, ферментативного гидролиза экструдатов, смешивания с безглютеновыми злаками или бобовыми, повторное экструдирование высоковлажной смеси с отбором пара и последующая подсушка полученных гранул экструдата.

Также возможным является использование метода высоковлажной экструзии, в процессе которой смесь ингредиентов также, как и в случае обычной термопластической экструзии, будет перемешиваться, проходить баротермообработку, формироваться в жгуты и нарезаться, но полученные экструдаты потребуют в качестве заключительной стадии этапа выпечки при режимах производства печенья.

Лимитирующим фактором при получении таких продуктов, проэкструдированных или выпеченных на последней стадии, может стать высокое содержание в составе редуцирующих сахаров. Так как высокотемпературная обработка, даже кратковременная, потенциально ведет к значительному меланоидинообразованию в результате реакции Майяра. Поэтому необходимо исключить или ограничить использование ФС, обладающих глюкоамилазной или амилолитической активностью. Важным в дальнейших исследованиях является изучение и подбор эффективных ферментативных систем для элиминации глютена, а также изучение возможности получения гидролизатов с максимально возможной концентрацией сухих веществ с соответствующим подбором гидролитических ферментов для гидролиза небелковых биополимеров зерна в целях снижения вязкости гидролизатов.

Заключение

Описанные в релевантной научной литературе перспективные биотехнологические подходы к элиминации глютена связаны с двумя направлениями – энзимотерапия, предполагающая пероральный прием препаратов, содержащих специфичную к глютену протеазу, и использование заквасок на основе молочнокислых бактерий. Оба направления имеют определенные ограничения в применении, поэтому разработка промышленных технологий элиминации глютена в продуктах из злаков трибы Triticeae, а также овса является актуальной. Проведенный анализ релевантных литературных источников по проблеме непереносимости глютена, потенциальных способов его элиминации на основе процессов биоконверсии, а также дополнительных способов глубокой модификации глютена физико-химическими способами переработки показал перспективность совмещения процессов экструзии и биокатализа для элиминации глютена при получении снеков на основе зерна пшеницы. Изучение влияния различных ферментных систем и процесса экструзии на гидролиз белков пшеницы показало, что экструдирование значительно снижает молекулярную массу продуктов последующего гидролиза белков пшеницы при использовании ферментных систем различной субстратной специфичности, что делает этот процесс перспективным на этапе предобработки сырья перед биокатализом. Исследования показали, что ферментный комплекс КФПА в сравнении с другими изучаемыми ферментными системами обеспечил наиболее эффективный гидролиз белков пшеницы за счет наличия в составе эндопептидазы, специфичной к катализу фракции пролина, ассоциированной с аллергенностью зерна. Предложен алгоритм технологии снеков из пшеницы на основе процессов экструзии и биокатализа белков специфичными протеазами для элиминации глютена.

Работа проведена за счет средств госбюджета на выполнение государственного задания по ПНИ Тема № 0410-2020-001.