Разработка лабораторных моделей in vitro иммунного микроокружения опухоли для оценки параметров качества и специфической эффективности дендритно-клеточной вакцины

Доклинические исследования вакцины на основе аутологичных ДК для лечения больных злокачественными опухолями являются важным этапом разработки клеточных продуктов. В первую очередь разрабатываются концепция и дизайн доклинических исследований клеточного препарата [1, 2]. В настоящее время отмечается явный разрыв между клиникой и биомедицинской наукой. Процесс исследований и разработок новых клеточных препаратов с выходом на клинические исследования, с последующим внедрением в клиническую практику занимает много лет, часто из-за низкой воспроизводимости и применимости доклинических результатов в клинике [3]. Стратегическим решением для преодоления этих препятствий является разработка лабораторных моделей для транс- ляционных исследований аутологичной вакцины на основе зрелых ДК и обоснования показателей качества клеточного продукта, обеспечивающих безопасность медицинского применения и клиническую эффективность [1, 3, 4].

Процесс производства клеточного препарата на основе аутoлoгичных ДК уникален для каждого пациента. Следoвательно, разработка лабораторного регламента пoлучения оптимизированного и стандартизированного клеточного препарата на основе зрелых ДК для обеспечения стабильного качества должна прoвoдиться с учетом функциональных осoбенностей клеточного продукта [5]. Анализ жизнеспособности и иммунологический фенотип не предоставляют полноценной инфoрмации о фактической функциональной активности ДК. Для оцeнки спoсoбнoсти ДК aктивировать aнтигeн-спeцифичeские T-лимфoциты и вызывать их прoлифeрацию долгое время зoлoтым стандартом считался метoд смeшанной культуры лимфoцитoв, oднакo данный тест не oтражал всех аспектов взаимодeйствия ДК и T-клeток. Многие разработчики ДКВ используют анализ костиму-ляции (англ. «COSTIM bioassay») с применением анти-CD3 антител для субоптимальной активации Т-лимфоцитов, который был валидирован для оценки эффективности ДКВ и может использоваться в клинических исследованиях [5, 6].

Анализ COSTIM в основном позволяет определять функцию костимулирующих молекул на ДК, таких как CD54, CD80 и CD86. Учитывая, что пролиферация Т-клеток не коррелирует напрямую с конкретными представленными антигенами, биологическая значимость этого метода требует дальнейшего изучения. Необходимо разработать in vitro модель, демонстрирующую, что использование ДК, нагруженных специфическим опухолевым антигеном, приведет к появлению Т-клеток, способных атаковать опухолевые клетки, экспрессирующие конкретный(ые) антиген(ы) [7, 8].

Получение вакцин на основе аутологичных ДК с заданными характеристиками, способных индуцировать противоопухолевый иммунный ответ, требует контроля этих характеристик, а также доклинической оценки противоопухолевой эффективности клеточного продукта. В статье представлены результаты разработки требований к качеству персонализированной аутологичной ДКВ, включающие контроль иммунофенотипических характеристик, проведена адаптация метода оценки функциональной активности Т-лимфоцитов при индукции зрелыми вакцинными ДК, разработан лабораторный регламент получения антиген-специфических Т-лимфоцитов, обладающих противоопухолевой цитотоксической активностью против клеток аутологичной опухоли.

Цель исследования ‒ разработка in vitro лабораторных моделей для оценки параметров качества и специфической эффективности дендритноклеточной вакцины (ДКВ).

Материал и методы

В исследование включены биологические образцы пациентов с диссеминированными формами меланомы кожи или сарком (включая остеогенные саркомы и саркомы мягких тканей), которые получали лечение аутологичной ДКВ на основе РТА+ в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова Минздрава России. Протокол исследования одобрен этическим комитетом НМИЦ, от всех пациентов получено информированное согласие.

Специфическую пролиферативную активность Т-лимфоцитов изучали с применением персонализированных клеточных систем, состоящих из клеток-эффекторов в виде мононуклеаров периферической крови (МНПК), выделенных по стандартной методике (n=227). Для индукции пролиферации антиген-специфических Т-лимфоцитов использовали незрелые ДК (n=46) и зрелые ДК (n=56), нагруженные РТА+. С целью изучения противоопухолевой активности цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) были разработаны 2D in vitro модели, в которых использовали опухолевые клетки меланомы кожи (n=10) или сарком (n=8) пациентов и генерированные in vitro аутологичные ЦТЛ (n=18). Противоопухолевое действие оценивали с использованием аналитической системы xCELLigence®, также изучали секрецию цитокинов и цитолитических белков методом мультиплексного анализа и определяли субпопуляционный состав эффекторных Т-лимфоцитов методом проточной цитометрии.

Для получения аутологичной вакцины на основе ДК, активированных РТА+ опухолевым лизатом, использовали адгезионную фракцию моноцитов (CD14+), полученную из периферической крови онкологических больных. Для дифференцировки ДК применяли сбалансированную бессывороточ-ную среду «Cell-Gro DC» (СellGenix, Германия) в культуральных флаконах с повышенной адгезией (TPP, Швейцария) при температуре 37 °С, 5 % CO2 и влажности 98 %. Ростовые факторы и факторы дифференцировки добавляли на 1, 3, 5-й дни культивирования: гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF, 72 нг/ мл) и интерлейкин-4 (IL-4, 20 нг/мл) (СellGenix, Германия). Для нагрузки и специфической активации к незрелым ДК (фенотип CD14-CD1a+) на 7-й день культивирования добавляли коктейль предварительно лизированных аллогенных опухолевых клеточных линий с подтвержденной экспрессией высокоиммуногенных РТА+ (GAGE+, MAGE+, NY-ESO-1+, HAGE+). Были использованы клеточные линии 226 АВ mel, 283 mel, Mel 311, 515 mel, mel 520 DVA, 685 mel GSN, 686 mel FLA, 860 mel BII, mel 929 SVU; генетическая аутентификация клеточных линий была подтверждена методом STR-анализа (ООО «GORDIZ», Москва). Лизированные опухолевые клетки добавляли к ДК в соотношении 3:1 (патент на изобретение № 2714208 от 13.02.2020), одновременно в культуральные флаконы вносили ростовые факторы: фактор некроза опухоли (TNF-α, 20 нг/мл), IL-4 (20 нг/мл) и GM-SCF (72 нг/мл). Спустя 48 ч получали ДК с фенотипом CD1a-CD83+, которые собирали и осаждали центрифугированием.

Незрелые и зрелые ДК оценивали на предмет экспрессии линейноспецифических и дифферен-цировочных антигенов методом лазерной проточной цитофлуориметрии BD FACSCantoII (BD, США) с использованием моноклональных антител, конъюгированных с флуорохромами: CD14-FITC, CD1а-APC, CD83-PE-Cy7, CD80-APC-Cy7, CD86-PerCP-Cy5.5, CD40-PE, HLA-DR-APC-Cy7, CD209-PerCP-Cy5.5, CCR7-BV421) [9, 10].

При оценке индуцированной Т-клеточной пролиферации для окрашивания Т-лимфоцитов применяли флуоресцентный краситель CFSE (5 мкМоль/мл). В качестве индукторов пролиферации эффекторных Т-лимфоцитов использовали ДК в соотношении 10:1. Относительное содержание пролиферировавших Т-клеток оценивали на 5-й день кокультивирования по разведению флуоресцентной метки методом проточной цитометрии (FACS Canto™ II, BD Biosciences, США) с помощью программного обеспечения BD FACSDiva (версия 8.0.1). Показатель спонтанной пролиферации лимфоцитов, меченных CFSE, использовали в качестве отрицательного контроля.

Культивирование опухолевых клеток проводили в соответствии с методом R.I. Freshney [11] в собственной модификации. Опухолевые образцы, выделенные из операционного материала пациентов, размером не менее 1 см3 , немедленно доставляли в лабораторию. Для механической дезагрегации образца опухоли использовали одноразовые ме-диконы (BD Falcon, США) и медимашину (DACO, США). Опухолевые клетки культивировали в пластиковых флаконах (TTP, Швейцария) с использованием CO2-инкубатора «Heracel» (Termo Electron LTD GmbH, Германия) в стандартизированных условиях (температура 37 °С, содержание СО2 5 %, влажность 100 %). После культивирования в течение не менее 10 пассажей клеточные культуры использовали в исследовании.

Для изучения противоопухолевой активности цитотоксических Т-лимфоцитов использовали автоматический клеточный анализатор xCelligence (ACEA Bioscience Inc., США), оценка проводилась на основании изменения биологического сопротивления (импеданса) на электродах. Аутологичные опухолевые клетки пациентов (клетки-мишени) были иммобилизованы в лунку планшета «E-plate 16» (ACEA Bioscience Inc., США), далее вносили антиген-специфические Т-лимфоциты (клетки-эффекторы), полученные при индукции пролиферации in vitro зрелыми аутологичными ДК. Взаимодействие клеток с биосенсорами измеряли с помощью клеточного индекса (CI), который рассчитывали по формуле CI = (RbRn)/t, где Rb – фоновое значение импеданса в лунке планшета; Rn – значение импеданса в момент времени t, который коррелирует с числом, размером и качеством прикрепления клеток к субстрату. Увеличение CI соответствует пролиферации клеток-мишеней, в то время как снижение представляет собой гибель клеток-мишеней. Сигнал импеданса регистрировали каждые 15 мин, наблюдение продолжали до 96 ч. Математический анализ полученных кривых проводили с использованием углового коэффициента линейной зависимости (Slope) [12]. Производили забор супернатанта клеточных культур до и через 72 ч после добавления Т-клеток для измерения содержания цитокинов.

Количественная оценка продукции цитокинов и цитолитических белков проведена методом мультиплексного анализа Bio-Plex 200 (Bio-Rad, США) с использованием наборов реагентов 8-Plex (Bio-Rad, США) для определения в биологических жидкостях следующих аналитов: интерферон гамма (IFN-γ), GM-CSF, TNF-α, интерлейкины IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 и IL-10.

Субпопуляционный состав пролиферирующих Т-лимфоцитов, индуцированных зрелыми ДК в лабораторных моделях, изучали на проточном цитометре (FACS Canto™ II, BD Biosciense, США), с применением моноклональных антител (BD Biosciense, США), конъюгированных с флуо-рохромами: CD45RA-PE, CD28-PerCP-Cy™5.5, CD8-PE-Cy7, CD3-APC, CD45-APC-Cy7, CD197-BV421 (CCR7) и программы BD FACSDiva (версия 8.0.1). Для определения антиген-специфической продукции гранзима Б (GrB) цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ) проводили внутриклеточное окрашивание клеток моноклональными антителами с использованием соответствующих протоколов фиксации и пермеабилизации мембран (BD Cytofix/Cytoperm™).

Анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения IBM SPSS 19.0 и Microsoft Excel 2010. Для статистической обработки результатов применяли методы описательной статистики, методы непараметрического статистического анализа с использованием коэффициента корреляции Спирмена, для оценки различий между двумя независимыми выборками ‒ U-критерия Манна–Уитни и для связанных выборок ‒ критерия Уилкоксона. Для сравнения медиан нескольких выборок применяли H-критерий Краскела–Уоллеса [13].

Результаты

Для разработки требований к качеству персонализированной вакцины на основе аутологичных ДК нами проведена лабораторная оценка экспрессии линейноспецифических и дифференцировочных антигенов аутологичных ДК, дифференцированных из моноцитов периферической крови. Сравнительное изучение иммунофенотипических особенностей ДК выполнено на разных стадиях созревания. Согласно полученным результатам (табл. 1, рис. 1), показана дифференцировка моноцитов в незрелые ДК, из которых путем дальнейшей нагрузки РТА+ опухолевым лизатом получили зрелые вакцинные ДК. На рис. 2 представлены микрофотографии зрелых вакцинных ДК, нагруженных высокоиммуногенными опухолевыми антигенами.

Для адаптации метода оценки индуцированной Т-клеточной пролиферации нами предварительно было проведено изучение оптимального соотношения клеток-эффекторов (МНПК) и вакцинных ДК разной степени зрелости (10:1), определены условия кокультивирования и сроки максимальной

Òàблицà 1/Table 1

Ñðàвнитåльныé àнàлиз иммóнîфåнîтипà ДÊ нà ðàзныõ ñтàдияõ ñîзðåвàния Comparative analysis of DC immunophenotype at different stages of maturation

Дифференцировочные/ линейноспецифические антигены/ Differential/Lineage-specific antigens	ДК незрелые (7-й день) (%) mediana (min-max)/ DC immature (Day 7) (%) mediana (min-max)	ДК зрелые (9-й день) (%) mediana (min-max)/ DC mature (Day 9) (%) mediana (min-max)	Mann–Whitney Test, уровень значимости (p), достоверность различий/ Mann–Whitney Test, significance level (p), significance of differences
CD14+	0,8 (0–7,1)	0,35 (0,1‒2,3)	p=0,200 (>0,05)
CD1a+	48,15 (19,6–65,1)	14,1 (3,3‒74,8)	p=0,025 (<0,05)
CD83+	57,2 (15,3–98,2)	91,1 (43,6–99,9)	p=0,063 (>0,05)
CD1a+ CD83-	13,4 (0,7–42,2)	0,35 (0–8,2)	p=0,004 (<0,05)
CD1a+CD83+	19,2 (5,5–61,6)	13,9 (3,5–73,3)	p=0,200 (>0,05)
CD1a-CD83+	24,4 (0,8–65,9)	64,7 (24,2–87,4)	p=0,001 (<0,05)
CD83+ CD86+	39,45 (2,8–84,5)	79,4 (40,5–96,8)	p=0,042 (<0,05)
CD83+ CD80+	30,45 (12,6‒75,0)	70,6 (38,2–92,8)	p=0,015 (<0,05)
CD83+ CD209+	70,3 (12,6–91,2)	77,35 (29,6–92,8)	p=0,200 (>0,05)
CD209+	92,4 (83,5–97,2)	85,0 (31,2–93,3)	p=0,033 (<0,05)
CCR7+	0,3 (0,1–0,6)	2,25 (0,3‒18,0)	p=0,004 (<0,05)
HLA DR+	95,3 (83,3–97,3)	97,5 (79,9–99,4)	p=0,120 (>0,05)

Рис. 1. Иммунофенотип вакцинных ДК на разных стадиях созревания. Степень зрелости ДК определяют по коэкспрессии антигенов CD1а и CD83 (А, Б). Повышение уровня экспрессии костимулирующих молекул CD80, CD86 характерно для зрелых ДК (В, Г). Нижняя и верхняя граница ящика ‒ 25-й и 75-й процентили соответственно; линия внутри ящика – медиана (50-й процентиль); точка в центре ящика – среднее значение показателя. Концы усов – минимум и максимум полученных значений. Использовался критерий Уилкоксона

Fig. 1. Immunophenotype of vaccine DCs at different stages of maturation. The degree of maturity of DCs is determined by the co-expression of CD1a and CD83 antigens (A, B). An increased level of expression of costimulatory molecules CD80, CD86 is characteristic of mature DCs (C, D). Lower and upper box boundaries: 25th and 75th percentiles, respectively, the line inside of the box: median, the point in the center of the box: mean. The whisker ends: the minimum and maximum of observed values. The Wilcoxon Signet Rank Test criterion was used

Рис. 2. Дендритные клетки человека в культуре (пациент Д., 36 лет, диагноз плеоморфная рабдомиосаркома), изображение, сопровождаемое сагиттальным и аксиальным срезом монослоя: А – незрелые дендритные клетки; Б – зрелые активированные дендритные клетки, которые характеризуются более вытянутым клеточным телом, наличием многочисленных псевдоподий (белая стрелка) и ламеллоподий (желтая стрелка), увеличением количества лизосом. Конфокальный микроскоп Olympus FV3000 (Япония), ×600. ■ – ядра, DAPI; ■ – цитоскелет, актин, Alexa Fluor 488; ■ – митохондрии, Alexa Fluor 555; ■ – лизосомы, Alexa Fluor 647

Fig. 2. Human dendritic cells in culture (patient D., 36 years old, diagnosed with pleomorphic rhabdomyosarcoma), image accompanied by sagittal and axial section of the monolayer. A – immature dendritic cells, B – mature activated dendritic cells characterized by a more elongated cell body, the presence of numerous pseudopodia (white arrow) and lamellopodia (yellow arrow), increased number of lysosomes. Confocal microscope Olympus FV3000 (Japan), ×600. ■ – Nuclei, DAPI; ■ – Cytoskeleton, actin, Alexa Fluor 488; ■ – Mitochondria, Alexa Fluor 555; ■ – Lysosomes, Alexa Fluor 647

Рис. 3. Сравнительная оценка антигенспецифической пролиферации Т-лимфоцитов в присутствии зрелых вакцинных ДК, нагруженных РТА+, и опухолевых антигенов (РТА+) (А), незрелых и зрелых вакцинных ДК, нагруженных РТА+ (Б) из банка биологических образцов НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова. Нижняя и верхняя граница ящика ‒ 25-й и 75-й процентили соответственно; линия внутри ящика – медиана (50-й процентиль); точка в центре ящика – среднее значение показателя. Концы усов – минимум и максимум полученных значений. Использовался критерий Уилкоксона

Fig. 3. Comparative evaluation of antigen-specific proliferation of T-lymphocytes in the presence of mature vaccine DCs loaded with CTA+ and tumor antigens (CTA+) (A), immature and mature vaccine DCs loaded with CTA+ (B) from the biological sample bank of the N.N. Petrov Research Center for Oncology. Lower and upper box boundaries: 25th and 75th percentiles, respectively, the line inside of the box: median, the point in the center of the box: mean. The whisker ends: the minimum and maximum of observed values. The Wilcoxon Signet Rank Test criterion was used

пролиферативной активности Т-лимфоцитов (5-й день) [14]. Разработку метода контроля качества клеточного продукта на основе ДК по увеличению относительного содержания пролиферирующих Т-клеток in vitro проводили в присутствии незрелых и зрелых вакцинных ДК. Как было показано, зрелые ДК (CD83+CD1a-) отличаются высокой экспрессией молекул, презентирующих антиген (HLA-DR) и обеспечивающих миграцию ДК в лимфатические узлы (CCR7), а также костимули- рующих молекул CD80 и CD86, по сравнению с незрелыми ДК (CD83-CD1a+). Индукция зрелыми ДК стимулирует статистически значимое повышение относительного содержания пролиферирующих Т-лимфоцитов (медиана 26,7 %, min-max – 5,4–72,6 %) по сравнению со стимуляцией незрелыми ДК (медиана 13,3 %, min-max – 3,5–31,6 %, рис. 3А) (р<0,001) и стимуляцией специфическим РТА+ опухолевым лизатом (медиана 1,75 %, minmax – 0,7–6,0 %, рис. 3Б) (р<0,001).

Рис. 4. Изучение специфической цитотоксической активности эффекторных Т-лимфоцитов in vitro , генерированных в присутствии вакцинных ДК, в отношении аутологичной опухолевой культуры, при соотношении эффектор/мишень 10:1. Черная кривая показывает естественный рост опухолевых клеток (контроль), зеленая кривая демонстрирует изменение пролиферативной активности опухолевых клеток при добавлении эффекторных Т-лимфоцитов (модель № 1 (А), модель № 2 (В). Сравнительный анализ секреции цитокинов и растворимых медиаторов супернатанта клеточных культур до (точка 1) и после (точка 2) добавления эффекторных Т-лимфоцитов в модели № 1 (Б), модели № 2 (Г).

Примечание: * – уровень значимости соответствует p<0,050, использовался H-критерий Краскела–Уоллеса Fig. 4. Study of specific cytotoxic activity of effector T-lymphocytes in vitro – generated in the presence of vaccine DCs against autologous tumor culture, at an effector/target ratio of 10:1. The black curve shows the natural growth of tumor cells (control), the green curve demonstrates the change in proliferative activity of tumor cells with the addition of effector T lymphocytes (model № 1 (A), model № 2 (B). Comparative analysis of cytokine and soluble mediator secretion of cell culture supernatant before (point 1) and after (point 2) addition of effector T-lymphocytes in model № 1 (B), model № 2 (D).

Note: * – significance level corresponds to p<0.050, Kraskel–Wallace H-criterion was used

Для динамического мониторинга специфической цитотоксической активности эффекторных Т-клеток использовали разработанную 2D in vitro модель с оценкой с помощью аналитической системы xCELLigence®. Аутологичные опухолевые клетки кокультивировали с генерированными in vitro Т-лимфоцитами, выделенными из периферической крови 18 пациентов с меланомой кожи (n=10) или саркомой (n=8), которые получали лечение ДКВ.

Прикрепление клеток аутологичной опухоли и их непрерывный рост были зарегистрированы только в лунках с опухолевыми клетками (черная линия – рис. 4А, В), в то время как клетки-эффекторы не генерируют устойчивый сигнал импеданса (синяя линия – рис. 4А, В). Однако при добавлении in vitro генерированных эффекторных Т-лимфоцитов было выявлено 2 типа взаимодействия с аутологичными опухолевыми клетками: 1) лабораторная модель № 1 – снижение клеточного индекса (CI) культуры клеток аутологичной опухоли под влиянием активированных эффекторных Т-лимфоцитов по сравнению с контролем было выявлено у 7 паци- ентов (зеленая линия – рис. 4А), среднее изменение углового коэффициента Slope за 72 ч наблюдения – 81 %; 2) лабораторная модель № 2 – отсутствие изменений CI культуры клеток аутологичной опухоли при ее кокультивировании с активированными клетками-эффекторами по сравнению с контролем (зеленая линия – рис. 4В), у 11 пациентов среднее изменение параметра Slope за 72 ч наблюдения равно 10 %.

Для изучения специфической цитотоксической активности in vitro генерированных эффекторных Т-лимфоцитов в разработанных лабораторных моделях провели сравнительный анализ секреции восьми цитокинов и растворимых медиаторов супернатанта клеточных культур (рис. 4Б, Г) .

В результате анализа фенотипа антиген-специфических Т-лимфоцитов, пролиферирующих in vitro в присутствии вакцинных ДК в изучаемых лабораторных моделях, выделены основные субпопуляции Т-клеток: наивные ЦТЛ, ЦТЛ центральной памяти, терминально-дифференцированные цитотоксические Т-лимфоциты (TEMRA), ЦТЛ, продуцирующие GrB. В качестве показателя ци-

Рис. 5. Сравнительный анализ субпопуляционного состава антигенспецифических Т-лимфоцитов in vitro , пролиферирующих в присутствии вакцинных ДК, активированных РТА+ в экспериментальных моделях. Исследуемые субпопуляции: наивные ЦТЛ – CD3+CD8+CD45RA+CD45RO-CD62L+CCR7+CD27+ (А); ЦТЛ центральной памяти –

CD3+CD8+CD45RA-CD45RO+CD62L+CCR7+CD27+ (Б); терминально-дифференцированные цитотоксические Т-лимфоциты (TEMRA) – CD3+CD8+CD45RA+CD45RO-CD62L-CCR7-CD27- (В); ЦТЛ продуцирующие гранзим Б – CD3+CD8+GrB+ (Г). Нижняя и верхняя граница ящика ‒ 25-й и 75-й процентили соответственно; линия внутри ящика – медиана (50-й процентиль); точка в центре ящика – среднее значение показателя. Концы усов – минимум и максимум полученных значений.

Использовался U-критерий Манна–Уитни

Fig. 5. Comparative analysis of subpopulation composition of antigen-specific T lymphocytes in vitro – proliferating in the presence of vaccine DCs activated by CTA+ in experimental models. Subpopulations studied: naive CTLs – CD3+CD8+CD45RA+CD45RO-CD62L+CCR7+CD27+ (A); central memory CTLs – CD3+CD8+CD45RA-CD45RO+CD62L+CCR7+CD27+ (B); terminal differential cytotoxic T lymphocytes (TEMRA) – CD3+CD8+CD45RA+CD45RO-CD62L-CCR7-CD27- (C); granzyme B-producing CTLs – CD3+CD8+GrB+ (D). Lower and upper box boundaries: 25th and 75th percentiles, respectively, the line inside of the box: median, the point in the center of the box: mean. The whisker ends: the minimum and maximum of observed values. Mann–Whitney U-test was used

тотоксического потенциала использовали метод внутриклеточного окрашивания GrB. Результаты сравнительного анализа иммунофенотипа эффекторных CD8+ Т-клеток представлены на рис. 5.

Обсуждение

Согласно многочисленным публикациям, посвященным анализу протоколов получения зрелых ДК для клинического применения, для созревания ДК характерен ряд морфологических, фенотипических и функциональных изменений, оно сопровождается потерей адгезивных молекулярных структур и реорганизацией цитоскелета, при этом показано увеличение подвижности ДК [15]. В организме в процессе активации ДК происходит их миграция в дренирующие лимфатические узлы. В это время клетки претерпевают транскрипционные изменения, в результате чего снижается их способность к эндоцитозу и повышается экспрессия маркера CD83, костимулирующих молекул (CD80, CD86, CD40) и белков, задействованных в презентации антигена (таких как HLA-DR). Кроме того, вместо хемокиновых рецепторов CCR1 и CCR5 наблюдается экспрессия рецепторов CCR7 [16].

Нами проведено сравнительное изучение особенностей ДК на разных стадиях созревания (7-й день культивирования – незрелые ДК, 9-й день – зрелые ДК). Полученные результаты свидетельствуют о связи дифференцировки моноцитов в незрелые ДК с утратой маркера CD14 (медиана 0,8 %, min-max – 0–7,1 %) и появлением поверхностной молекулы CD1a (медиана 48,1 %, min-max – 19,6–65,1 %). Для зрелых ДК характерны снижение экспрессии CD1a (медиана 14,1 %, min-max – 3,3– 74,8 %), высокий уровень экспрессии молекулы CD83 (медиана 91,1 %, min-max – 043,6–99,9 %), усиление экспрессии молекул костимуляции CD80 с 30,45 % (min-max – 12,6–75,0 %) до 70,6 % (minmax – 38,2–92,8 %) (р=0,015) и CD86 с 39,45 % (min-max – 2,8–84,5 %) до 79,4 % (min-max – 40,5– 96,8 %) (р=0,042). Высокий уровень экспрессии на мембране ДК поверхностных белков, обеспечивающих презентацию антигена (HLA-DR), в изучаемые сроки культивирования также является признаком созревания ДК. Анализ полученных результатов продемонстрировал снижение содержания в культуре незрелых CD1a+CD83-ДК с 13,4 до 0,35 % (p=0,004) и увеличение количества зрелых CD1a-CD83+ ДК с 24,4 до 64,75 % (p=0,001) к 9-му дню культивирования. Присутствие молекулы DC-SIGN (CD209) на поверхности ДК CD209+CD83+ способствует активному эндоцитозу, а также участию в процессах сосудистого роллинга и их миграции из кровотока в ткани. Учитывая, что от степени зрелости ДК напрямую зависят стабильность и продолжительность контактов между этими клетками и наивными Т-лимфоцитами, что обеспечивает формирование иммунных синапсов, нами разработан лабораторный метод оценки качества препарата ДК, основанный на определении иммунофенотипических характеристик незрелых и зрелых РТА+ вакцинных ДК методом проточной цитометрии.

В работе Y. Tai et al. [17] пoказанo, что клoнальная экспансия лимфоцитoв после их стимуляции зрелыми ДК является oсновным параметром, который используется при прoведении контрoля качества и при oценке эффективнoсти противooпухолевых клеточных вакцин. В нашем исследовании была проведена oценка специфичности пролиферации Т-лимфoцитов в присутствии вакцинных ДК разной степени зрелости и показанo, что стимуляция только зрелыми ДК способствует формированию клона антиген-специфических Т-клеток в отличие от индукции незрелыми ДК или РТА+ oпухолевым лизатом. В других работах также было показано, что взаимодействие с незрелыми ДК приводит к анергии Т-лимфоцитов [18], препятствует активации ЦТЛ и способствует прогрессированию опухоли [19]. Для проведения контроля качества и мониторинга эффективности противоопухолевых клеточных вакцин нами адаптирована методика оценки функциональнoй активности Т-лимфоцитов при стимуляции зрелыми антиген-специфическими ДК.

В настоящее время для оценки противоопухолевого эффекта ДКВ in vitro разрабатываются многокомпонентные (гетеротипические) модели, включающие помимо опухолевых клеток эффекторные Т-лимфоциты [20,21]. В работе P.V. Pham et al. [22] зрелые ДК, нагруженные лизатом стволовых клеток РМЖ, инкубировали с Т-лимфоцитами, а затем добавляли эту клеточную суспензию к монослою опухолевых клеток. Для оценки цитотоксического эффекта праймированных лимфоцитов использовали анализатор xCELLigence, измеряя снижение пролиферации клеток РМЖ в режиме реального времени.

В разработанной нами лабораторной модели с использованием аналитической системы xCELLigence® для изучения специфической цитотоксической активности эффекторных Т-лимфоцитов был проведен сравнительный ана- лиз секреции восьми цитокинов и растворимых медиаторов супернатанта клеточных культур. Было установлено, что увеличилось содержание цитокинов, которые опосредуют и поддерживают разрушение клеток-мишеней IL-2 с 35,1 до 312,4 пг/мл (p<0,001); TNF-α – с 246,4 до 2525,0 пг/мл (p<0,001) через 48 ч после добавления клеток-эффекторов в лабораторной модели № 1 не менее чем в 10 раз. Кроме того, данная модель характеризуется увеличением продукции GM-CSF, IFN-γ, IL-8, IL-10, но уровня статистической значимости не достигнуто. Особенностью секреции цитокинов в лабораторной модели № 2 является низкое содержание IL-6 как до внесения клеток-эффекторов, так и через 48 ч инкубации (5395,0 и 3505,0 пг/мл соответственно, р=0,200), по сравнению с моделью № 1 (p=0,027), где отмечены более высокие концентрация IL-6 до и после внесения активированных ЦТЛ (10560,0 и 8561,0 пг/мл, р=0,038), отсутствие роста TNF-α при добавлении эффекторных Т-лимфоцитов и изначально высокий уровень IL-10.

В литературе также имеются противоречивые данные о том, что IL-6 в опухолевом микроокружении способствует как дифференцировке иммуносупрессивных опухоль-ассоциированных макрофагов, миелоидных супрессорных клеток [23, 24], толерогенных ДК [25], так и дифференцировке, активации и пролиферации Т-лимфоцитов [24, 26]. IL-10 описан как мощный иммуносупрессивный фактор, способствующий привлечению в опухоль Treg и подавлению NK-клеток [27, 28], а также дифференцировке макрофагов в М2 [29, 30] и приобретению ДК толерогенного фенотипа [25, 31]. Таким образом, определение поляризации иммунного микроокружения в направлении противоопухолевого фенотипа тесно связано с определенным профилем секреции цитокинов.

Присутствие эффекторных клеток в опухолевом очаге, их локализация и отсутствие иммуносупрессивных клеток связаны с реализацией противоопухолевого иммунного ответа [32]. Антиген-специфические CD8⁺ Т-лимфоциты являются важнейшим медиатором клеточного иммунного ответа благодаря их способности разрушать опухолевые клетки, поэтому цитотоксический потенциал клеток-эффекторов является важным параметром для обеспечения эффективности ДКВ и требует разработки методов оценки качества клеточного препарата. Проведенный нами сравнительный анализ субпопуляционного состава антиген-специфических Т-лимфоцитов, пролиферирующих in vitro в присутствии вакцинных ДК, подтверждает существенный сдвиг в лабораторной модели №1 в сторону сокращения количества наивных ЦТЛ CD3+CD8+CD45RA+CD45RO-CD62L+CCR7+CD27+ менее 29 % (p=0,044) и увеличение процентного содержания цитотоксических эффекторных Т-лимфоцитов CD3+CD8+CD45RA+CD45RO-CD62L-CCR7-

CD27- (TEMRA) более 45,8 % (p=0,026) относительно аналогичных показателей в модели № 2, что говорит о наличии выраженного активационного процесса в пуле ЦТЛ. Эффекторные CD8+ Т-лимфоциты реализуют свою функцию с помощью цитолитических белков, содержащихся в литических гранулах [33]. Большую часть этих белков составляют гранзимы – сериновые протеазы, способные активировать каспазы и индуцировать апоптоз, и перфорины – белки, формирующие каналы в плазматической мембране и способствующие проникновению гранзимов внутрь клетки-мишени [34]. Определение экспрессии гранзима B в ответ на взаимодействие с антигеном позволяет напрямую оценить количество антиген-специфичных ЦТЛ. В нашей работе цитотоксическую способность РТА+ специфических Т-лимфоцитов в отношении аутологичной опухоли в лабораторной модели № 1 демонстрирует высокое содержание CD3+CD8+GrB+ клеток (до 41,9 %) по сравнению с низким содержанием подобных клеток в лабораторной модели № 2 – 28,6 % (p=0,036). При этом существенных различий в количестве ЦТЛ центральной памяти CD3+CD8+CD45RA-CD45RO+CD62L+CCR7+CD27+ не обнаружено.

Таким образом, ДК выполняют функции профессиональных АПК: захватывают опухолевые антигены, дифференцируются в зрелые ДК, мигрируют в лимфатические узлы и презентируют антигены в контексте молекул главного комплекса гистосовместимости Т-лимфоцитам, одновременно экспрессируя костимулирующие молекулы и секретируя цитокины. В результате происходят индукция противоопухолевого антиген-специфического клеточного иммунного ответа и элиминация опухолевых клеток. Однако компоненты опухолевого микроокружения активно влияют на эти процессы, препятствуя созреванию и миграции ДК, способствуя формированию толерогенного фенотипа этих клеток. Изучение клеточных и молекулярных ком- понентов иммунного микроокружения опухоли in vitro необходимо для оценки параметров качества и специфической эффективности ДКВ.