Разработка метода детекции мутаций гена K-ras с помощью аллель-специфичной ПЦР в реальном времени

Новосибирский государственный университет ООО «Биолинк», г. Новосибирск

Препараты Цетуксимаб (Merck Serono, США) и Панитумумаб (Amgen, США) созданы на основе моноклональных антител к эпителиальному фактору роста EGFR. Эти препараты крайне эффективны в таргетной терапии метастазирующего колоректального рака (мКРР). Однако в 30% опухолей КРР выявляются мутации 12 или 13 кодонов онкогена K-Ras, такие опухоли устойчивы к анти-EGFR терапии. Анализ статуса K-Ras необходим для идентификации пациентов, которым показана анти-EGFR терапия.

Целью работы является разработка метода детекции мутаций K-Ras в срезах опухолей, фиксированных формалином и заключенных в парафин.

Материал и методы. ДНК культур клеток с разными мутациями по 12 и 13 кодонам K-Ras была получена от д-ра Юнга (Мюнхен, ФРГ). Срезы опухолей КРР с известным статусом K-Ras по данным аллель-специфичной ПЦР были предоставлены проф. Е.Н. Имянитовым (г. Санкт-Петербург, Россия). ДНК из срезов опухолей выделяли с помощью набора QIAamp DNA FFPE tissue kit (Qiagen). Контрольная ДНК с геном K-Ras дикого типа была выделена из плаценты человека. Аллель-специфичную ПЦР в реальном времени (АС-рвПЦР) для гена K-Ras проводили на термоциклере iCycler iQ5 с детекцией продуктов по флуоресценции SybrGreen.

Результаты. Разработаны и тестированы аллель-специфичные праймеры для мутаций 12 и 13 кодонов K-Ras. Определены условия для достижения максимальной чувствительности и специфичности АС-рвПЦР K-Ras. В модельных экспериментах с ДНК из культуры клеток АС-рвПЦР позволяет детектировать 5% мутантной

ДНК K-Ras в препарате содержащем 5 нг суммарной ДНК. Эксперименты по определению чувствительности метода при тестировании ДНК, выделенной из срезов фиксированных опухолей, проводятся в настоящее время и будут представлены в докладе.

Выводы. Разработан метод АС-ПЦР в реальном времени для детекции мутаций гена K-Ras в опухолях.