Разработка метода количественного определения нового производного гамма-аминомасляной кислоты в биологических пробах

Биологические жидкости – очень сложные объекты для выполнения анализа, так как они представляют собой многокомпонентные смеси, включающие большое число неорганических и органических соединений различной химической структуры. Большое значение имеет выбор метода проведения биофармацевтического анализа, он должен иметь высокую чувствительность, возможность работы с малыми объемами проб, большую специфичность и избирательность, надежность, воспроизводимость и универсальность. Данным требованиям отвечает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), являющийся одним из основных аналитических методов при проведении фармакокинетических исследований. Этот этап обязателен при проведении доклинических и клинических исследований новых лекарственных препаратов с использованием методов доказательной медицины [1].

Среди путей создания новых лекарственных препаратов наиболее перспективным и продуктивным остается принцип модификации структуры эндогенных физиологически активных соединений, в частности, производных гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК). Так получен целый ряд лекарственных препаратов: пирацетам, группа рацетамов, аминалон, оксибутират натрия, фе-нибут, баклофен, пикамилон, фенотропил и др., нашедшие широкое применение в клинической практике [3].

Ранее нами был разработан метод ВЭЖХ с диодноматричным УФ-детектированием для проведения фармакокинетических исследований фенибута и цитрокарда [2].

При количественном определении нового производного ГАМК, имеющего естественную флуоресценцию, нами был разработан метод ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием, обладающий большей чувствительностью и селективностью по сравнению с использованием УФ-детектора.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Разработать методы количественного определения нового производного ГАМК в биологических пробах для проведения дальнейших фармакокинетических исследований.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Содержание вещества определяли методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Shimadzu (Япония) с флуоресцентным детектором RF-10Axl, колонка SUPELCOSIL LC-18 (5 мкм; 150 мм х 4,6 мм).

Для приготовления мобильной фазы использовали ацетонитрил (УФ210, Россия) и буферную систему, состоящую из однозамещенного фосфата калия 50 mМоль, pH 4,65 (Россия) в соотношении 12 : 88.

Субстанцию фиксировали при длине волны экстинции 210 нм и длине волны эмиссии 285 нм. Чувствительность метода составляет 0,5 мкг/мл. Идентификацию исследуемого вещества и расчет концентрации проводили по методу абсолютных стандартов. Время удерживания для производного ГАМК составило 7–8 минут.

Извлечение производного ГАМК, а также одновременное осаждение белков из биологических проб производили из плазмы, сыворотки и цельной крови, а также из 20%-х водных гомогенатов органов и тканей крыс. В качестве экстрагентов использовали ацетонитрил, метанол и концентрированную соляную кислоту. Наилучшей экстракции удалось достичь с использованием концентрированной HCl в соотношении с плазмой 1 : 0,2.

Образцы встряхивали в течение десяти минут в ультразвуковой ванне для преципитации белков и центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об./мин на центрифуге Eppendorf, после чего надосадочную жидкость отбирали и вводили в инжектор с объемом петли 20 мкл. Степень извлечения для исследуемого вещества составляет 90 %.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯИ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для количественного определения вещества использовали метод абсолютной калибровки. Зависимость площадей пиков от концентрации производного ГАМК анализировалась методом регрессионного анализа в диапазоне концентраций от 0,1 до 10 мкг/мл (рис. 1, 2).

Рис. 1. Хроматограмма производного ГАМК в воде (1 мкг/мл)

Рис. 2. Хроматограмма производного ГАМК в плазме (10 мкг/мл)

В результате было установлено, что калибровочные кривые носят линейный характер, с коэффициентом регрессии (R2) равным 0,99 (рис. 3). Были определены внутридневные процентные колебания (повторяемость метода), которые не превышали 20 % в изучаемых диапазонах концентраций. Междневные процентные колебания (воспроизводимость метода) для изучаемого соединения не превышали в основном 10 % (см. табл.).

При повторном проведении анализа, после 72 часов хранения водных растворов соедине- ния при комнатной температуре, средние абсолютные процентные колебания находились в тех же пределах, показывая стабильность изучаемого вещества. При изучении влияния процессов замораживания и таяния, было обнаружено, что средние абсолютные процентные колебания для производного ГАМК находились в тех же пределах, что определяет стабильность вещества под влиянием данных факторов. Чувствительность метода для изучаемого соединения составляет 0,5 мкг/мл. Средняя ошибка измерения не превышает 10 %.

Рис. 3. Зависимость площади под хроматографическим пиком от концентрации производного ГАМК:

x – площадь под хроматографическим пиком, mAU*мин; y – концентрация производного ГАМК мкг/мл

Показатели воспроизводимости и повторяемости метода количественного определения производного ГАМК с использованием ВЭЖХ в диапазоне линейной зависимости площади хроматографического пика от концентрации растворов (M ± m)

Концентрация, мкг/мл	Внутридневные колебания концентрации, мкг/мл			Повторяемость, ± ∆ %			Воспроизводимость (ср. ошибка измерения), %
	1-й день	2-й день	3-й день	1-й день	2-й день	3-й день
0,1	0,13 ± 0,01	0,15 ± 0,02	0,14 ± 0,005	28,89	49,82	49,81	42,84
0,25	0,21 ± 0,02	0,32± 0,01	0,31± 0,04	–15,78	29,77	23,43	22,99
0,5	0,43 ± 0,04	0,53 ± 0,05	0,64 ± 0,09	–14,86	5,97	27,59	16,14
1	0,97 ± 0,14	1,2 ± 0,11	1,13 ± 0,16	–2,85921	20,13	13,15	12,04
10	7,48 ± 0,47	12 ± 0,99	12 ± 0,99	–25,14	20,03	20,07	21,75

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, для анализа производного ГАМК разработан метод хроматографии на обра-щеннофазной колонке С18 с флуоресцентным детектированием. Данный хроматографический метод обладает достаточной селективностью и позволит определять в биологических пробах как само лекарственное вещество, так и его возможные метаболиты.

Метод извлечения подобран оптимально и практически не влияет на среднюю ошибку измерения хроматографического метода количественного определения.

Таким образом, разработанный метод количественного определения является высокоселек- тивным и высокочувствительным, что позволяет эффективно использовать его для проведения фармакокинетических исследований различных производных ГАМК.