Разработка методики исследования элементного состава биопроб методом масс-спектрометрии тлеющего разряда

Новые технические возможности в медицинских исследованиях позволили в последние десятилетия существенно расширить понимание роли различных процессов и факторов, отвечающих за здоровое функционирование живого организма. Одним из таких факторов является элементный статус организма. Микроэлементы Fe, J, Cu, Zn, Ni, Se, Mn, F, Si, Li и многие другие принимают активное участие в биохимических процессах, протекающих в организме. В связи с этим зачастую для диагностики различных патологических состояний и ряда заболеваний необходимым и достаточным является точное количественное определение элементного состава микроэлементов, характерного для пациента. В качестве объекта исследования могут использоваться различные ткани и биологические жидкости организма. Количественное определение содержания элементов в биопробах в первую очередь связано с разработкой методик их измерения. Все эти методики включают в себя стадии пробоподготовки и стадии анализа и должны учитывать целый ряд специфических свойств биопробы, таких как неоднородность химического состава и большой набор содержащихся в пробе элементов, имеющих к тому же значительный разброс в концентрациях. На сегодняшний день основными методами элементного анализа биопроб являются: атомноадсорбционная спектроскопия (ААС) и различные методы эмиссионной спектроскопии, прежде всего с возбуждением в индуктивно связанной плазме (ИСП-АЭС). Среди масс-спектрометрических методов элементного анализа, наиболее информационных и экспрессных, для анализа биопроб использовалась только ИСП-МС — масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой, но анализы этим методом достаточно дорогие и требуют использования особо чистых реактивов. Успехи масс-спектрометрии с тлеющим разрядом (ТлР-МС) как метода, альтернативного ИСП-МС, не требующего растворения пробы и потребляющего на три порядка меньше аргона, чем ИСП-МС, побудили провести исследования возможности ТлР-МС в задаче определения элементного статуса организма.

• 1.    ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

• 2.    ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ УСТАНОВКА И ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

В качестве объекта исследования для определения концентраций микро- и макроэлементов, содержащихся в организме, была выбрана нативная кровь. Благодаря большой подвижности и проникающей способности крови, она является информативным показателем состояния организма в течение относительно небольшого отрезка времени перед анализом, в то время как распространенные для такого анализа биопробы, такие как волосы или ногти, являющиеся тканями-накопителями, хорошо представляют элементный статус организма за длительное время. Для проведения анализа необходим перевод исследуемой биологической пробы в однородное состояние с максимально высокой концентрацией микроэлементов. Такой перевод может быть осуществлен с помощью процедуры минерализации1). В результате минерализации пробы крови, проводимой при высокой температуре в атмосфере инертного газа, образуется смесь солей и окислов элементов, содержащихся в крови. Эта сложная смесь, содержащая в основном соединения железа, натрия и калия и в виде микропримесей соединения многих других элементов, в дальнейшем может быть проанализирована методом ТлР-МС.

На первых стадиях разработки методики решения данной задачи достаточно использовать модельные соли тех элементов, присутствие которых в крови представляет наибольший интерес с медицинской точки зрения [1].

Исследования проводились на приборе МСД-650ТлР, разработанном в ИАП РАН [2]. В приборе используется статический масс-анализатор с двойной фокусировкой прямой геометрии (Е-М), обеспечивающий при ионизации электронным ударом возможность получения высокой рабочей разрешающей способности R 10% : порядка 10 000. В рабочем режиме при ионизации электронным ударом давление паров остаточного газа в камере анализатора поддерживается на уровне 0.5– 1∙10^–4 Па. Для реализации ионизации твердых проб методом тлеющего разряда источник ионов с электронным ударом был заменен на источник ионов с тлеющим разрядом.

В этом источнике ионы анализируемого вещества образуются в плазме тлеющего разряда, сконцентрированной в ячейке. На рис. 1 представлена схема газоразрядной ячейки источника ионов с тлеющим разрядом. Основными элементами являются: система подачи аргона в разряд, диафрагма с отверстием для экстракции ионов вещества, анод и катод. Исследуемое вещество представляет собой собственно катод или помещается на его поверхность. При подключении напряжения, составляющего в рабочем режиме ~1000 В, в пространстве между анодом и катодом зажигается разряд. Ток разряда составляет 1–2.5 мА, давление газа в ячейке поддерживается на уровне 1 мм рт. ст.

Выходя из газоразрядной ячейки через отверстие в аноде, ионы материала катода и балластного газа ускоряются полем в направлении сетки, ориентированной параллельно анодной поверхности, и, пройдя систему корректирующих линз, входят в масс-анализатор масс-спектрометра. Регистрация сигнала ведется либо на коллекторе Фарадея, либо на электронном умножителе; последующая обработка данных и контроль измерительного процесса ведется на управляющем компьютере. Получение обзорного масс-спектра происходило в два этапа: первый этап — получение серии спектров в режиме автоматической развертки магнитного поля и запись данных в файл; второй этап — проведение статистической обработки серии спектров с помощью специально разработанной для этого программы. Получаемые при

Рис. 1. Схематическое изображение разрядной ячейки источника ионов с тлеющим разрядом этом данные позволяют судить о степени достоверности и воспроизводимости результатов эксперимента.

Для определения предела обнаружения микропримесей использовался чистый цельнометаллический медный катод. При максимальном пропускании прибора, получаемом за счет снижения разрешающей способности до R 10% порядка 1000, отношение сигнал / шум для изотопов Сu составляет не менее 6 порядков, что соответствует возможности достижения пределов обнаружения на уровне 0.1–1 ppm.

Режимы регистрации спектров

Представление масс-спектра возможно осуществить в двух режимах.

• •    В режиме полного спектра масс-спек-трограмма графически представляется в виде набора пиков, снятых с учетом разброса погрешности определения массы иона. Такое представление аналогично наблюдаемому на экране осциллографа в режиме линейного спектра.

• •    На масс-спектрограмме отображаются только линии, соответствующие максимальному сигналу (максимальной интенсивности) для каждого пика.

• 3.    ОСОБЕННОСТИ РАСПЫЛЕНИЯ И ИОНИЗАЦИИ ПРОБ В ТЛЕЮЩЕМ РАЗРЯДЕ ПОСТОЯННОГО ТОКА

• 4.    ЭКСПЕРИМЕНТ

Обработка результатов измерений

Из-за нестабильности ряда внешних факто- ров: ускоряющего напряжения и магнитного поля, подачи рабочего газа, режима горения разряда и т. д. — в серии масс-спектров наблюдались колебания в оцифрованных значениях масс и амплитуд пиков от спектра к спектру. Поэтому для интерпретации масс-спектров использовались спектры, значения интенсивностей и масс в которых находились по следующему алгоритму. Для набора из 50 линейных масс-спектров (сканов), записанных друг за другом через небольшой промежуток времени (величина промежутка задается программно и составляет десятые доли секунды), производится идентификация пиков одного и того же массового числа и составляется набор из 50 соответствующих значений интенсивности (в относительных единицах) и массы для каждого пика. Затем рассчитываются математические ожидания и среднеквадратичные отклонения для каждого пика.

Традиционно источник ионов с тлеющим разрядом постоянного тока используют при элементном анализе проводящих образцов, как правило металлов. Теоретический анализ показывает, однако, что метод ионизации в тлеющем разряде может быть применим и для анализа плохопрово-дящих и непроводящих образцов, таких как соли и окислы металлов, хотя на практике это сопряжено с трудностями, о которых будет сказано ниже.

Механизм ионизации вещества проводящей пробы следующий. Ионы аргона, образовавшиеся в плазме отрицательного свечения тлеющего разряда, разгоняясь в темном катодном пространстве под действием поля, достигают катода и производят его распыление. Кроме того, при столкновении с нейтральными атомами аргона в процессе симметричной перезарядки ионы полностью передают атомам свою энергию, в результате чего образуются быстрые атомы, интенсивность которых может на несколько порядков превосходить интенсивность ионов, принимающих участие в распылении. По данным работы [8] вклад ионов аргона и быстрых атомов в распыление катода составляет примерно 30 и 60 %. Распыленные атомы исследуемого вещества (катода), попадая в область отрицательного свечения, ионизуются преимущественно при столкновении с метастабильными атомами аргона. Образовавшиеся таким образом ионы экстрагируются из плазмы за счет градиента давления через отверстие в разрядной ячейке и входят в область ионно-оптической системы источника, затем ускоряются и формируются в пучок, который вводится в аналитическую часть масс-спектрометра.

Механизм распыления диэлектриков несколько иной. Главное отличие заключается в том, что образец распыляется не в виде нейтральных частиц, как это было в предыдущем случае, а виде положительных и отрицательных ионов, в связи с тем что в диэлектрике нет свободных электронов, которые могли бы произвести нейтрализацию вылетающей частицы [3]. Вторым отличием является то, что участие ионов в распылении диэлектриков минимально из-за образования положительного заряда на поверхности последних, и поэтому можно считать, что диэлектрики практически распыляются быстрыми атомами. Распыление в виде ионов диэлектрика, нанесенного на катод, создает значительные проблемы при формировании ионного пучка диэлектрической пробы, поскольку положительные ионы стремятся вернуться обратно на катод, а отрицательные осаждаются на аноде.

Помимо трудностей, связанных с получением ионов и их отбором из ячейки, сложность анализа диэлектрических веществ в масс-спектрометрии тлеющего разряда постоянного тока состоит в необходимости предварительной подготовки пробы в соответствии с определенным требованиями. Все они сводятся к приданию анализируемому веществу тем или иным способом проводящих свойств. Из литературы известны два используемых способа: первый — это перемешивание порошка пробы и металлической стружки с последующим прессованием смеси [4]. Второй способ — это организация вторичного катода, которая заключается в размещении металлической диафрагмы на лицевой поверхности исследуемого непроводящего материала [5]. Плохо проводящие образцы также можно исследовать в импульсном или радиочастотном тлеющих разрядах. Однако такие источники ионов, хоть и обладают некоторыми преимуществами перед источниками с тлеющим разрядом при постоянном токе (например, возможностью анализа как проводящих, так и непроводящих материалов, меньшей температурой разогревания катода), до сих пор не реализованы в коммерческих приборах.

Пробоподготовка

В качестве модельных солей для исследования в тлеющем разряде использовались хлорид цинка и ацетат никеля. Указанные соли были технически чистыми, т. е. содержали набор микропримесей, однако на начальном этапе исследований примеси в этих солях не исследовались. Также не ограничивался размер пробы: навески солей для анализа брались, как правило, большими и составляли примерно 10–20 мг.

Поскольку существенной проблемой было закрепление порошкообразной соли на поверхности медного катода одновременно с обеспечением ее достаточной проводимости для поддержания разряда, было рассмотрено несколько схем нанесения пробы на катод.

• 1.    Крепление в отверстиях медного катода. На поверхности катода были проделаны отверстия диаметром 1 мм и глубиной 2–3 мм, в которые прессовалась измельченная проба. Этот метод пробоподготовки аналогичен методике вторичного катода.

• 2.    Применение электропроводящей смазки "Аквадаг" для закрепления пробы. Основной компонент смазки — углерод. Кроме того, распадаясь на составные части в разряде, "Аквадаг" вносит дополнительные компоненты в масс-спектр. Особенно интенсивные линии проявлялись в области малых (до М = 40) масс, что свидетельствует о наличии в составе смазки воды (как растворителя) и легколетучих органических соединений.

• 3.    Крепление соли с помощью индия. Поскольку температура разогрева катода в источнике ионов с тлеющим разрядом в рабочем режиме не превышает температуры плавления индия (176 °С), то благодаря своей пластичности индий может быть использован как связующий агент для исследуемых солей. Кроме того, индий — металл и, следовательно, обладает хорошими проводящими свойствами, что является необходимым условием для связующего агента при подготовке диэлектрической пробы к исследованиям в тлеющем разряде постоянного тока.

При использовании способов крепления 1 и 2 газовый разряд характеризовался нестабильным ионным током, работа источника сопровождалась активным загрязнением ячейки из-за ссыпания пробы с поверхности катода. В ходе экспериментов было показано, что оптимальным способом крепления соли является способ с использованием индия как связующего агента.

Описание эксперимента и результаты

Калибровка прибора была произведена по известным пикам изотопов меди Сu⁶³ , Cu⁶⁵ и аргона _Ar40_.

Экспериментально было подтверждено, что условия ионизации различны для ионов, образующихся из атомов и молекул материала катода, и для ионов, изначально присутствующих в газовой фазе (ионов аргона и его кластеров, ионов воздуха и воды), что позволяет путем подбора давления аргона и ускоряющего напряжения добиваться увеличения интенсивности пиков материала катода при одновременном снижении интенсивности нежелательных пиков. К подобному выводу пришли авторы работы [6]. В данной работе подбор условий разряда, при которых наблюдается мак- симально возможный сигнал интересующих нас ионов, производился в каждом эксперименте. При этом главным критерием в таком подборе параметров была форма пика: пики в масс-спектре должны были быть как можно более гладкими, симметричными, с максимальной интенсивностью.

Наиболее простой моделью "пробы" в источнике ионов с тлеющим разрядом является монометаллический катод. Для чистого медного катода после ~ 20 мин очистки в разряде оптимальные параметры газового разряда для получения максимальной интенсивности атомарных ионов меди Сu⁶³, Cu⁶⁵ были определены следующими: давление аргона Р арг ~ 100 Па; ток разряда i разр ~ 2.5 мА; напряжение U разр ~ 1000 B. Результаты определения изотопного отношения меди приведены в таблице.

Как видно, в эксперименте получено хорошее соответствие измеренного изотопного отношения табличному, что свидетельствует об отсутствии дискриминационных факторов в источнике ионов и масс-анализаторе. Далее измерение изотопных отношений меди рассматривалось как тестовое и периодически повторялось для подтверждения нормальной работы масс-спектрометра.

Для анализа модельных солей применялся следующий способ пробоподготовки.

Поверхность медного катода предварительно шлифовалась при помощи мелкозернистой наждачной бумаги для придания гладкости и протиралась растворителем. Затем на ней расплавлялась смесь индия с порошком исследуемой соли. Как показали эксперименты, таким способом удалось создать достаточно прочное крепление соли к поверхности катода и обеспечить ее проводимость, тем самым не нарушая условий горения разряда. При внесении пробы в источник ионов и зажигании разряда первоначально наблюдались резкие всплески давления в разрядной ячейке, о чем можно было судить по датчику давления, расположенному в промежуточной области, отделяю-

Сравнение экспериментально измеренных изотопных соотношений с табличными

Изотопные соотношения Табличные данные Эксперимент Сu63/Cu65 2.24 2.19 ± 0.06 Zn64/Zn66 1.76 1.53 ± 0.2 Zn66/Zn67 6.77 5.27 ± 2.1 Ni58/Ni60 2.59 2.17 ± 0.1 щей источник ионов от остальной части масс-спектрометра. Скорее всего, рост давления был вызван десорбцией газов и испарением влаги, изначально содержащейся в соли из-за ее гигроскопичности. Набор спектров снимался приблизительно через 1 ч после зажигания разряда, когда давление и ток разряда стабилизировались.

Суммарная масс-спектрограмма хлорида цинка на индии, полученная описанным в разделе 2 способом, приведена на рис. 2, а на рис. 3 — анало- гичная масс-спектрограмма для ацетата никеля. Изотопные отношения для меди, никеля и цинка приведены в таблице.

Значительная погрешность для изотопного отношения Zn66/Zn67 связана с нестабильностью пика, соответствующего малораспространенному изотопу Zn67. В масс-спектрах также наблюдались неидентифицированные пики с массами 57, 59 и 62, которые, видимо, связаны с органическими фрагментами солевого остатка.

+

Рис. 2. Масс-спектр хлорида цинка

Рис. 3. Масс-спектр ацетата никеля

ВЫВОДЫ

На основании проведенного исследования можно сделать следующие выводы.

• 1.    Теоретически и экспериментально показано, что методом тлеющего разряда можно проводить ионизацию непроводящих солей металлов, закрепленных на проводящей подложке.

• 2.    В качестве подложки удобно использовать катод из металлического индия, наплавленного на медную основу.

• 3.    Ионизация солей металлов в тлеющем разряде позволяет получить характерные спектры металлов и определить для них изотопные отношения.

• 4.    Масс-спектрометр МСД-650ТлР с источником ионов с тлеющим разрядом принципиально пригоден для элементного анализа биопроб.