Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов методом УФ-спектрофотометрии в биологически активной добавке "Арура-тан № 10"

В современных условиях, когда повышается напряженность ритма жизни, нарастает интенсивность стрессовых, психотравмирующих ситуаций, потребность в седативных препаратах возрастает. В медицинской практике широко используются седативные препараты растительного происхождения. Это обусловлено тем, что они обладают мягкостью лечебного действия, плавным нарастанием максимального терапевтического эффекта, не оказывают выраженного побочного действия, не вызывают аллергических реакций и привыкания. Препараты из лекарственного растительного сырья рекомендуются не только больным, но и здоровым людям для повышения сопротивляемости организма и коррекции нарушений.

Нами была разработана биологически активная добавка (БАД) к пище на основе изучения данных литературы о химическом составе растений, об использовании их в прописях тибетской медицины и проведенного фармакологического скрининга. БАД представляет собой смесь сухих измельченных лекарственных растений: пустырник сердечный, соплодия хмеля обыкновенного, плоды шиповника майского (коричного) и др. видов, листья мяты перечной, корни шлемника байкальского, ноготки лекарственные.

В последние годы для вновь создаваемой продукции предъявляется высокая степень стандартизации как для лекарственных сборов, так и для БАД к пище. В связи с этим нами предложена методика стандартизации сбора, основанная на спектрофотометрическом определении суммы флавоноидов, поскольку флавоноиды являются доминирующей группой биологически активных веществ, входящих в состав сбора, во многом обусловливая их суммарный фармакологический эффект.

Материалы и методы

Объектом для исследования служили образцы растений.

Высушенное воздушным способом сырье измельчали и просеивали через сито с диаметром отверстий 2-5 мм. Для исследования использовали воздушно-сухое сырье с содержанием влаги от 9,06 до 12,00 %.

Исследование качественного состава проводили методом одномерной и двумерной хроматографии на бумаге марки «Filtrak» FN-16, в системах растворителей:

• 1)    н-бутанол-уксусная кислота – вода (4:1:2);

• 2)    уксусная кислота 15 %.

Обнаружение и их идентификацию проводили методом сравнения со стандартными образцами, для этого использовали 0,05 %-ные растворы государственных стандартных образцов (ГСО): рутина, кверцетина, мирицетина, гиперозида, лютеолина.

При разработке методик количественного определения были использованы хроматографически чистые вещества – стандарты (лютеалин).

Разработке методики количественного определения предшествовала работа по изучению поглощений в УФ-области спектра водного и водно-спиртового извлечений.

Для этого было приготовлено водное и водно-спиртовое извлечение по следующей методике:

Около 1,0 г воздушно-сухого сырья чая «Арура-Тан №10» поместили в колбу объемом 250 мл, прибавили 100 мл 70 %-ного этилового спирта или 100 мл воды очищенной, присоединили к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 минут с момента закипания водной или водно-спиртовой смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл через бумажный фильтр, и объем доводили соответствующим растворителем до метки (раствор А).

• 2    мл раствора А поместили в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводили соответствующим растворителем до метки и перемешивали [1].

Спектр поглощения полученного раствора снимали в диапазоне длин волн 210-400 нм на спектрофотометре ГЕЛИОС (USU) в кювете с толщиной слоя 10 мм. Параллельно снимали УФ-спектры раствора РСО лютеолина в 70 %-ном этиловом спирте.

Количественное определение флавоноидов проводили по следующей методике: около 1,00 г (точная навеска) исходной композиции БАД «Арура-Тан №10», предварительно измельченной и просеянной через сито с диаметром отверстия 2 мм, перенесли в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавили 100 мл 70 %-ного этилового спирта. Колбу присоединили к обратному холодильнику и нагревали ее на кипящей водяной бане в течение 30 минут, периодически встряхивали для смывания частиц со стенок. Затем извлечение процеживали через вату в мерную колбу вместимостью 100 мл, избегая попадания частиц на вату, и объем доводили до метки тем же растворителем (раствор А). 2 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 25 прибавили 2 мл 5 % раствора алюминия хлорида в 95 % этиловом спирте. Довели объем тем же спиртом до метки, перемешали и через 30 мин измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 400±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 см.

В качестве раствора сравнения использовали раствор: 2 мл испытуемого раствора; 0,1 мл разведенной уксусной кислоты довели 95 % этиловым спиртом до метки в колбе вместимостью 25 мл. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора РСО рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

Результаты и обсуждения

Хроматограммы просматривали при дневном свете, УФ-свете до и после обработки 5 %-ным спиртовым раствором алюминия хлорида. На хроматограммах обнаружено 8 зон фенольных соединений, которые обладают собственной флуоресценцией желтого, голубого и фиолетового цвета. После обработки 5 %-ным спиртовым раствором алюминия хлорида флуоресценция усилилась. Обнаружены и идентифицированы: рутин, кверцетин, лютеолин.

Нами проведена работа по изучению поглощений в УФ-области спектра водного и водноспиртового извлечений.

Установлено, что УФ-спектр водного извлечения из растительной композиции имеет максимум поглощения при 290 нм, УФ-спектр водно-спиртового извлечения чая (на 70% этаноле) с раствором хлорида алюминия имеет максимум поглощения 400 нм. УФ-спектры близки со спектрами растворов лютеолина, снятых в аналогичных условиях. Для дальнейших исследований нами выбран стандартный образец – лютеолин.

Оптимизированы технологические параметры экстракции чая. Оптимальным экстрагентом выбран 70 %-ный этанол, условия экстракции – однократная экстракция, время экстракции – 30 минут, степень измельчения сбора – 2,0 мм, количество раствора алюминия хлорида – 2 мл при концентрации 5 %.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:

D* *m*100*100*100

Х = D*m**100*(100-W), где

D – оптическая плотность испытуемого раствора;

D o – оптическая плотность РСО лютеолина;

• m – масса чая в граммах;

• m – масса РСО рутина в граммах;

W– потеря в массе при высушивании сырья в процентах

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в различных сериях чая составило от 2,0 до 4,5 %. Для нормативной документации мы рекомендуем норму – не менее 1,5% суммы флаво- ноидов в пересчете на лютеолин-стандарт.

Заключение

Таким образом установлено, что в БАД к пище «Арура-Тан №10» содержатся флавоноиды, которые обладают седативным, противовоспалительным, антимикробным, антиоксидантным, спазмолитическим, мембраностабилизирующим действием. Для количественного определения флавоноидов в БАД разработана методика УФ-спектрофотомерии. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин должно быть не менее 1,5%.