Разработка методов и устройств для экспресс мониторинга микробного загрязнения

Одним из опасных и вредных факторов труда в ряде отраслей АПК является биологический. Наибольший вред здоровью работающих причиняют микроорганизмы . В общей численности занятых, инфицирование ветеринарных работников достигает 20-65%, чабанов -25-100%, доярок - 15-30%, пастухов, скотников - 25-53%. В структуре профессиональной патологии работников животноводства доля бруцеллеза превышает 90%, а доля всех инфекционных и паразитарных заболеваний – 65%. В структуре заболеваний с временной утратой трудоспособности высок удельный вес простудных заболеваний, связанных со снижением иммунитета персонала вследствие воздействия микробного фактора - 42-53% [1].

Как показали исследования, концентрация микробного аэрозоля в птицеводческих хозяйствах и при переработке ветеринарно-санитарного брака в 2-5 раз превышает ПДК, при этом в составе микроорганизмов обнаруживается до 40-50% условно-патогенных и патогенных видов [3].

В связи с этим, возрастает необходимость контроля микробного загрязнения производственной среды. Однако существующие методы выделения и контроля численности микроорганизмов трудоемки, требуют наличия специализированной лаборатории и персонала соответствующей квалификации [4]. Трудности, связанные с оперативной оценкой микробного загрязнения вызывают необходимость перехода к новым низко трудоемким и затратным системам экспресс мониторинга этого фактора [5].

В настоящей работе для выделения микроорганизмов использовались методы смывов, аспирации по МУК 4.2.734-99 и конденсации с помощью модуля Пельтье [2]. Численность микроорганизмов оценивалась культуральным методом с использованием мясо-пептонного агара и по изменению электрического импеданса культуральной жидкости [9].

Для извлечения микроорганизмов из воздуха нами предлагается прибор, состоящий из стеклянного адсорбера барботационного типа, к выходному патрубку которого подсоединяется воздухозаборная трубка респиратора марки «Бриз-1» с расходомером, рассчитанным на отбор проб воздуха в количестве 2 л/мин. В адсорбер наливают 10 мл 1% раствора глюкозы , прибор помещают в исследуемую зону, и включают аспиратор на 15 минут. При этом микроорганизмы, находящиеся в воздухе, проходящем через раствор глюкозы , задерживаются раствором.

Затем раствор переливают в пробирку и термостатируют в течение двух часов в устройстве, представленном на рисунке 1.

Рисунок 1 – Устройство для определения численности микробов в пробе 1 – термостат; 2 – камера; 3 – пробирка;

4 – нагревательный элемент; 5 – термодатчик;

6 – устройство регулировки температуры ; 7 – электроды;

8 – генератор; 9 – регистрирующий прибор; 10 – общий блок питания

Пробирку 3 устанавливают в камеру 2 термостата 1. Термостат управляется устройством регулировки температуры 6, снабженным нагревательным элементом 4 и термодатчиком 5.

В процессе термостатирования микробы используют глюкозу и образуют кислые продукты жизнедеятельности, которые изменяют удельную электропроводность раствора.

Для определения удельной электропроводности культуральной жидкости через электроды 7, помещенные в пробирку, от генератора 8 пропускают ток. Изменение удельной электропроводности фиксируют регистрирующим прибором 9. Питание установки осуществляется элементом 10.

Для определения численности микробов в воздухе рабочей зоны служит график зависимости удельной электропроводности раствора от числа микробов (рис. 2).

число микробов в 1 м3 воздуха, тыс. КОЕ

Рисунок 2 – График для определения численности микробов в воздухе

Значение электропроводности, зафиксированное датчиком, откладывают на оси ординат, из данной точки проводят прямую линию до пересечения с графиком, а затем опускают вертикаль на ось абсцисс. Точка пересечения вертикали с осью абсцисс будет соответствовать искомой величине численности микробов.

Помимо оценки микробной обсемененности воздуха необходимо также контролировать степень загрязнения спецодежды микроорганизмами с тем, чтобы определить периодичность ее стирки и дезинфекции.

Традиционный метод извлечения микроорганизмов с поверхностей – метод смывов не дает адекватного представления о численности микроорганизмов.

Кроме того, недостатками данного метода являются трудоемкость , длительность анализа, необходимость в специалисте-микробиологе, а также невозможность извлечения микробов из толщи материала, что не позволяет определить полную микробную загрязненности материалов спецодежды. Поэтому нами предложен метод конденсации с использованием модуля Пельтье.

Элемент Пельтье — это термоэлектрический преобразователь , принцип действия которого базируется на возникновении разности температур при протекании электрического тока. При этом одна сторона элемента охлаждается, а другая нагревается.

Произведен расчет времени максимально возможного термоэлектрического охлаждения ΔΤmах, достаточного для максимальной конденсации микроорганизмов на поверхности модуля Пельтье, но не вызывающего их гибели.

Математическая формулировка задачи имеет следующий вид:

d ² T i ² p 1 dT

—2- +--—           (1)

dx k a dt

T(x,0)= T 0 = const      (2)

dT

dx

dT kdx

— 0

x ^^

— 0

x — 0

где к – удельную теплопроводность термоэлектрических материалов ветвей термоэлемента;

• ρ – удельное сопротивление термоэлектрических материалов ветвей термоэлемента;

• α – коэффициент термо-э.д.с;

• а – температуропроводность термоэлемента;

t – время.

Решение задачи имеет следующий вид:

A T — T o - T ( 0, t ) — T o

- exp A erfci

- 2 a ( ^ZT 0 1 ' , ⁽⁵⁾

где A — a iy/atk ¹, Z — a²k ¹ p ¹

Разность ΔТ между начальной температурой Tо и температурой холодного спая в любой момент времени может быть выражена через два определяющих критерия, ZТо и А. Критерий ZТо характеризует эффективность термоэлектрических материалов.

Максимально достижимая разность температур в нестационарном режиме при использовании импульса тока прямоугольной формы находится следующим образом. Продолжительность импульса -время t_m наступления максимума ΔТ . Исследование (5) на экстремум показывает, что ΔТ имеет максимум при А = А_о. При этом А_о определяется соотношением ZT₀ — (7 П A exp AerfcA )( 1 - П АA exp A 2 erfcA 0 ) ' (6)

Из структуры критерия Ао следует соотношение: i tm”—const.

Зная зависимость А_о от ZТ_о, можно определить ΔΤ m ах , подставив А о в формулу 6.

Момент времени tm, когда ΔТ достигает максимального значения, определяется следующим соотношением t m

1 Г A 0 k ) ² a v a i )

Произведенный расчет показал, что для полной конденсации влаги, находящейся в образце пористого материала толщиной 1-5 мм на поверхности модуля Пельтье необходимо охлаждение его от +20 до –1,5° С в течение 3-5 минут. Такая скорость охлаждения и величина температурного минимума, по мнению ряда авторов [6,7,8] не оказывает влияния на жизнеспособность большинства микроорганизмов. Для обеспечения указанных величин охлаждения, достаточно снабдить модуль Пельтье регулируемым блоком питания и электронным термометром.

Осуществлена сборка опытного образца установки, схема которой представлена на рисунке 3.

Рисунок 3 – Устройство для извлечения микробов из материала спецодежды 1 – модуль Пельтье; 2 – блок питания; 3 – электротермометр

Способ извлечения микробов из материалов спецодежды состоит в следующем. Спецодежда, находящаяся в носке, загрязняется микробами преимущественно в области рукавов и полочек. Из данных областей производят извлечение микробов с сохранением целостности изделия.

Для этого на охлаждаемую поверхность модуля Пельтье помещают стерильную полоску фильтровальной бумаги площадью 600 мм2, а сверху прижимают материал спецодежды изнаночной стороной в самых загрязненных областях изделия. Степень охлаждения модуля Пельтье управляется регулируемым блоком питания, температуру охлаждаемой стороны модуля Пельтье показывает электротермометр.

После включения устройства при достижении температуры конденсации на охлаждаемой поверхности модуля Пельтье появляется влага, образующаяся из паров, находящихся в исследуемом материале спецодежды и содержащая извлеченные из слоя материала спецодежды микробы, которые впитываются полоской фильтровальной бумаги. Эта полоска помещается в пробирку с 1% раствором глюкозы, инкубируется в термостате в течение 2 часов. Численность микроорганизмов определяется способом, изложенным выше с помощью графика, изображенного на рисунке 4.

Рисунок 4 – График для определения численности микробов в пробе

Для сравнения способов извлечения микробов из материала была получена чистая культура E. сoli, которая методом последовательных разведений в стерильном физиологическом растворе с контролем по стандарту мутности микробных взвесей и контрольных высевов разведена до следующих величин содержания микробов в 1 мл раствора (тыс. КОЕ): 10; 50; 250; 500 и 1000. Раствор распыляли с помощью дозатора аэрозолей на поверхность материала спецодежды на площади 600 мм2 (площадь, соответствующая рабочей поверхности элемента Пельтье).

Затем проводили извлечение микроорганизмов известным способом смывов с соответствующей площади и предлагаемым способом. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Численность микробов в материале спецодежды

Способы извлечения микробов	Численность микробов, тыс. КОЕ.
	В аэрозоле
	10 \	50    \	250	500	1000
	В материале
известный	6,4 ± 1,25	32,7 ± 3,48	156,4 ± 15,97	320,2 ± 52,61	620,5 ± 73,94
предлагаемый	8,5 ± 0,96	43,5 ± 2,54	218,8 ± 10,18	473,5 ± 24,35	910,0 ± 50,23

Результаты свидетельствуют о том, что количество микроорганизмов, выделенных из материала известным способом, составляет, в среднем, 63,6% от количества эксплицированных микробов. Величина данного показателя, полученная предлагаемым способом, составляет 89,0%.

Сравнение продолжительности предлагаемых нами способов извлечения и подсчета численности микроорганизмов в воздухе и материалах спецодежды с базовым вариантом представлено в таблице 2.

Таким образом, разработанные методики экспресс мониторинга микробного загрязнения значительно менее трудоемки по сравнению с существующими, не требуют наличия специализированной лаборатории и соответствующей профессиональной подготовки персонала, осуществляющего анализ . Устройства для экспресс-мониторинга микробного загрязнения имеются в виде опытных образцов на кафедре БЖ Д на производстве ФГБОУ ВПО Орел ГАУ.

Таблица 2 – Продолжительность определения численности микробов

Способы определения численности микробов	Производимые операции			Суммарное время анализа
	получение пробы, посев	инкубация	оценка численности ми кробов
известный	15-45 мин.	24 часа	10- 30 мин.	≈ 25 часов
предлагаемый	10-30 мин	2 часа	5 мин.	2 часа 25 мин.