Разработка обобщенной структурной схемы и концептуальной модели расчета амплификаторов ДНК

В статье представлены основные положения построения обобщенной структурной схемы амплификаторов ДНК, их классификация и концептуальная модель расчета. Обобщенная структурная схема является результатом проведенного обзора существующих конструктивных схем устройств данного типа и основой для разработки классификации амплификаторов ДНК. Представленная классификация позволяет синтезировать новые типы структурных схем устройств в зависимости от предъявляемых в каждом конкретном случае требований к амплификатору ДНК. Концептуальная модель необходима для создания частных математических моделей расчета конкретных типов амплификаторов ДНК.

ВВЕДЕНИЕ                   К рабочему телу (среде, в которой размещаются носители) тепло подводится от преобразователя

В 1983 г. Кэрри Б. Мюллисом был открыт про- энергии. В случае выделения тепла в рабочем теле,

цесс ПЦР (Polymerase Chain Reaction, PCR). ПЦР — это циклически повторяющаяся термическая обработка ДНК (денатурация, гибридизация праймеров и ферментативная достройка), в результате которой происходит квазиэкспоненциальное накопление копий определенного фрагмента исходной двухцепочечной ДНК [1]. Реализация температурного протокола для термической обработки ДНК осуществляется на программируемых устройствах нагрева/охлаждения, называемых амплификатора-ми ДНК. Амплификатор ДНК состоит из теплового блока и микропроцессорной системы управления. В России первые образцы амплификаторов были созданы еще в конце восьмидесятых годов прошлого века. В связи с постоянным совершенствованием технологии и методов ПЦР существует необходимость создания новых и более эффективных амплификаторов ДНК [2].

КЛАССИФИКАЦИЯ АМПЛИФИКАТОРОВ ДНК

На основе накопленного опыта по созданию, разработке и производству амплификаторов ДНК выявлены классификационные признаки основных элементов конструктивных схем тепловых блоков. Объект нагрева/охлаждения, которым в данном случае является реакционная смесь, находится в тепловом взаимодействии с носителем. Под термином "носитель" понимается тип лабораторных емкостей, в которых непосредственно помещается реакционная смесь и проводится ПЦР. В свою очередь носитель находится в тепловом взаимодействии с рабочим телом и внешней средой.

что возможно при его размещении в непосредственном контакте с преобразователями энергии, тепло подводится от (отводится к) преобразователя энергии внутри системы. В ряде вариантов исполнения подобных устройств преобразователь энергии для охлаждения находится в тепловом взаимодействии с теплообменным устройством. От теплообменного устройства тепло отводится во внешнюю среду потоком теплоносителя. Расход теплоносителя обеспечивается внешним побудителем расхода.

Таким образом, элементами теплового блока амплификатора ДНК являются:

• —    носитель;

• —    рабочее тело;

• —    преобразователь энергии;

• —    теплообменное устройство;

• — теплоноситель;

— побудитель расхода.

Применяемые носители

Самый распространенный тип носителей для ПЦР — пластиковые микропробирки различной емкости (рис. 1, а); планшеты, представляющие собой тонкостенную пластиковую пластину, отформованную в виде соединенных микропробирок (рис. 1, б), и капилляры — тонкостенные стеклянные или пластиковые трубки (рис. 1, в). В отдельных случаях применяются плоские носители, например предметные стекла (in situ) и биочипы™. Особой чертой капилляров является то, что в них наиболее эффективное соотношение поверхности теплообмена и объема реакционной смеси.

в

Рис. 1. Применяемые "носители": а — индивидуальная пробирка для ПЦР; б — ПЦР-планшет; в — ПЦР-капилляр

Рабочее тело

Первоначально разработчики амплификатов ДНК шли по пути создания конструкций, в которых тепло к пробиркам подводилось от жидкости (воды). В конструкциях данного типа (рис. 2) достигался наилучший тепловой контакт между рабочим телом и носителем. Однако недостатки, присущие данной схеме (проблемы с испарением воды, образованием накипи, обеспечением герметичности), не позволили широко ее использовать.

Воздух в качестве рабочей среды применялся в связи с достаточной простотой конструктивной схемы устройства. Но широкое распространение устройств, выполненных по данной схеме, было ограничено низкой точностью поддержания температуры и сложностью с обеспечением однородности теплового поля (рис. 3). В последнее время вернулись к использованию воздуха в качестве рабочего тела, т. к. появилась необходимость создания амплификаторов ДНК со скоростями нагрева и охлаждения реакционной смеси, близкими к 8 К/с, и, кроме того, появились методики проведения ПЦР, обеспечивающие достаточно устойчивые результаты при неоднородности температурного поля в пределах ± 0.5 К. Анализ данной конструктивной схемы амплификаторов ДНК показал возможность их широкого применения, особенно при проведении исследований при хорошо отработанных методиках и диагностических наборах. Подобные устройства могут быть созданы и в мобильном исполнении для работы в полевых условиях. Использование же их при проведении научных и диагностических исследований, требующих высокой точности ( ± 0.15 К) поддержания температуры реакционной смеси, ограничено.

Наибольшее распространение получили схемы амплификаторов ДНК, в которых в качестве рабочего тела используется твердое тело. Амплифика-торы ДНК данного типа эффективнее других совмещаются с электронными системами управления, обеспечивающими требуемые законы управления. Основной проблемой является обеспечение теплового контакта между микропробирками или планшетами и ячейками детали, в которых они установлены (рис. 4). С этой целью разработаны специальные конструкции тонкостенных микропробирок. Тепловой контакт обеспечивается плотным прилеганием внешней поверхности микропробирки, имеющей довольно сложный профиль, к внутренней поверхности ячейки.

Способ подвода/отвода тепла

Используются три основных варианта подво-да/отвода энергии от преобразователя энергии к рабочему телу:

• —    подвод/отвод тепла к рабочему телу / от рабочего тела;

• —    замещение рабочего тела;

• —    комбинированная схема.

В первом случае преобразование энергии в тепло происходит непосредственно в рабочем теле, находящемся в тепловом контакте с носителем.

Во втором варианте в состав амплификатора ДНК входят устройства, в которых заранее происходит нагрев рабочего тела до заданных температур. Для обеспечения требуемого температурного протокола в этом случае необходимо либо пере- местить микропробирки с реакционной смесью из одного блока в другой, в котором поддерживается другая температура (твердотельная схема), либо произвести замещение рабочего тела с одной температурой на новую порцию с другой температу- рой (жидкостная или пневматическая схемы, рис. 2). В устройствах с комбинированной схемой нагрев рабочего тела обеспечивается подводом тепла, а охлаждение — отводом за счет замещения рабочего тела (жидкость или воздух).

Рис. 2. Принципиальная схема жидкостного амплификатора ДНК

Рис. 3. Принципиальная схема пневматического амплификатора ДНК (воспроизведено из патента USA 5123477, 02.05.89)

8 17

|2ж»жмиаяк2г%2ггггиши%гг

Поток воздуха

Блок нагрева-охлаждения   Система управления

Рис. 4. Принципиальная схема теплового блока твердотельного амплификатора ДНК на основе термоэлектрических преобразователей энергии.

1 — пластина-держатель (рабочее тело); 2 — датчики температуры; 3 — радиатор (теплообменное устройство); 4 — воздушные каналы; 5 — термоэлектрические модули (преобразователи энергии); 6 — теплоизоляция; 7 — ограничитель потока воздуха; 8 — микропробирки (носители); 9 — предварительный усилитель; 10 — АЦП; 11 — микропроцессорное устройство; 12 — ЦАП; 13 — усилитель тока; 14 — источник тока; 15 — устройство ввода-вывода информации; 16 — внешняя ЭВМ; 17 — нагреваемая крышка

Способ преобразования энергии

Используются три основных способа преобразования энергии в тепло, необходимое для нагрева рабочего тела: нагрев за счет эффекта Джоуля, нагрев за счет термоэлектрических эффектов и нагрев излучением.

Преобразование электрической энергии в тепло за счет эффекта Джоуля — простой и широко распространенный способ. Устройства, в которых реализуется данный способ, отличаются простотой конструкции, достаточно низкой стоимостью и простотой эксплуатации.

Рис. 5. Обобщенная структурная схема амплификаторов ДНК

Для охлаждения образцов реакционной смеси в таких конструкциях должны применяться дополнительные устройства. Для этих целей применяются машинные способы получения холода или отвод тепла потоком воздуха или жидкости. В случае использования машинного способа получения холода возможна не только реализация универсального температурного протокола ПЦР, но и последующее охлаждение образцов до температуры 273...277 К. При отводе тепла потоком воздуха или жидкости с температурой окружающей среды нижняя температура ограничена.

Широкое распространение в амплификаторах ДНК получил способ преобразования электрической энергии, основанный на термоэлектрических эффектах. Данные устройства обладают такими преимуществами, как простота конструкции, низкая стоимость, отсутствие подвижных частей, хорошая совместимость с электронными системами управления и, самое главное, возможность использования преобразователя энергии как для нагрева, так и для охлаждения рабочей среды, поскольку направление передачи тепла в данном виде преобразователей зависит от полярности включения источника тока.

Способ нагрева рабочего тела тепловым излучением в настоящее время широкого применения не нашел.

Результаты проведенного обзора и анализа конструктивных схем позволили разработать общую классификацию амплификаторов ДНК, а выявленные классификационные признаки могут быть использованы при синтезе новых конструктивных решений тепловых блоков, основанных на различных физических принципах действия.

ПОСТРОЕНИЕ ОБОБЩЕННОЙ СТРУКТУРНОЙ СХЕМЫ И КОНЦЕПТУАЛЬНОЙ МОДЕЛИ

Список обозначений c — теплоемкость среды, Вт/(кг-К);

F g — вектор силы тяжести, Н;

n — вектор нормали к поверхности границы;

p — давление, Па;

s k _ l , s l _ k — взаимодействующие поверхности компонентов расчетной области;

S_T — мощность объемных источников, Вт/м³;

t — время, с;

Т — температура, К;

T f — температура жидкости, К;

u — вектор скорости , м/с;

a f — коэффициент теплоотдачи, Вт/(м² - К);

[ А ] =

A y А

А А

A y   А

— коэффициент

тепло-

проводности, Вт/(м - К);

ц — динамическая вязкость, Па - с;

р — плотность, кг/м³.

Анализ выявленных квалификационных признаков и условное графическое представление изложенного выше материала позволяют предложить обобщенную структурную схему амплифи-каторов ДНК, охватывающую практически все возможные варианты выполнения рассматриваемого типа оборудования (рис. 5). Обобщенная структурная схема является основой для разработки концептуальной модели расчета амплификато-ра ДНК, которая позволяет упростить процесс разработки частной математической модели для численного исследования конкретного типа ам-плификатора ДНК.

Построение концептуальной модели расчета амплификаторов ДНК основано на системе нестационарных уравнений в дифференциальной постановке, описывающих тепловое состояние теплового блока амплификатора ДНК, а также граничных, начальных и конечных условий [3, 4].

Система уравнений концептуальной модели, на основе которой могут быть сформированы частные математические модели различных вариантов амплификаторов ДНК, представлена в табл. 1. Тепловое взаимодействие между элементами концептуальной модели в каждом конкретном случае описывается вариантами граничных условий, представленных в табл. 2.

Для замыкания системы уравнений математической модели необходимо определить начальные условия в момент времени t = 0 для всех компонентов обобщенной структурной схемы:

T = Т ( t , x , y , z ) , p = p ( t , x , y , z ) , P = P ( t , x , y , z ) , u = u ( t , x , y , z ) .

Конечные условия расчета могут быть заданы различными вариантами:

• —    значение температуры какой-либо точки (области) достигло заданного значения Т к = Т ад. ;

• —    время расчета равно заданному t_K0H = t_3tid ;

— значение какой-либо другой характеристики достигло заданного значения X_кон = X_за д .

С использованием обобщенной структурной схемы и концептуальной модели были разработаны математические модели пневматического, гидравлического и твердотельных амплификаторов ДНК, а на их основе разработаны методики расчета и численного исследования амплификаторов ДНК.

Результаты проведенных исследований легли в основу создания семейства современных амплифи-каторов ДНК, различающихся по типам рабочих тел, производительности и предназначенных для  рок, планшетов и биочипов™ [5, 6].

применения в качестве носителей — микропроби-

Табл. 1. Концептуальная модель расчета

Компонент расчетной области	Уравнение энергии	Уравнение движения	Уравнение неразрывности
ПЦР-объект (реакционная смесь)	dP ^T + div [ ( p c ) • u • T - [ A ] • grad( T ) ] = S T	P d u = p F - grad p + p div(grad u ) d t       g	dp + div ( p u ) = 0
Носитель	dp^T + div [- [ A ] • grad( T ) ] = 0	—	—
Рабочее тело (твердое тело)	^ P'-T + div [- [ A ] • grad( T ) ] = 0	—	—
Рабочее тело (газ, жидкость)	d ( P c)' T + div [ ( p c ) • u • T - [ A ] • grad( T ) ] = 0	p — = p F, - grad p + p div(grad u ) d t       g	-p + div ( p u ) = 0
Преобразователь энергии	d ( P c)' T + div [- [ A ] • grad( T ) ] = S t	—	—
Теплообменное устройство	d ( P c) • T + div [- [ A ] • grad( T ) ] = 0	—	—
Теплоноситель	d ( Pc)' T + div [ ( p c ) • u • T - [ A ] • grad( T ) ] = 0	p — = p F, - grad p + p div(grad u ) d t       g	dp + div ( p u ) = 0

Табл. 2. Граничные условия

Взаимодействующие компоненты расчетной области		Для уравнений неразрывности и движения	Для уравнения энергии
Компонент l	Компонент k
1	2	3	4
ПЦР-объект (реакционная смесь)	Носитель	u = 0	( -[ A ] l grad T , n ) S k = ( -[ A ] k grad T , n ) S k l ’ k * l
Носитель	Рабочее тело (твердое тело)	—	( - [ A ] l grad T , n ) S ik = (-[ A ] k grad T , n ) S k i , k * l
	Рабочее тело (газ, жидкость)	u = 0	( - [ A ] grad T , n )|    = a f ( T - T f )|    , k * l S l - k                             lSk - 1
	Внешняя среда	u = 0	( - [ A ] grad T , n )|    = a f ( T - T f )|    , k * l 1 Sl - k          J                J lSk - 1

Табл. 2 ( продолжение )

1	2	3	4
Рабочее тело (твердое тело)	Носитель	—	( -[ A ] l grad T , n ) S k = ( - [ A ] k grad T , n ) S k - , к * I
	Преобразователь энергии	—	( -[ A ] l grad T , n ) S k = (-[ A ] k grad T , n ) S k - , k * l
	Внешняя среда	—	( - [ A ] grad T , n )    = a f (T -Tf )| , k * I S l - к                             lSk - 1
Рабочее тело (газ, жидкость)	Носитель	u = 0	( - [ A ] grad T , n )    = a f ( T - T f )| , k * I 1 Sl - к         J             J lSk - l
	Преобразователь энергии	u = 0	( - [ A ] grad T , n )     = a f (T - T f )| , к * I 1 Sl - к          J                J lSk - 1
	Внешняя среда	—	—
Преобразователь энергии	Теплообменное устройство	—	( -[ A ] l grad T , n ) S k = (-[ A ] k grad T , n ) S k i , k * l
	Внешняя среда	u = 0	( - [ A ] grad T , n )| S - k = af (T - Tf )| S k - 1 , k * I
Теплообменное устройство	Преобразователь энергии	—	( - [ A ] l grad T , n ) S i k = (-[ A ] k grad T , n ) S k i k * l
	Теплоноситель	u = 0	( - [ A ] grad T , n)|    = a f (T - Tf )| , k * I S l - к                             lSk - 1
	Внешняя среда	u = 0	( - [ A ] grad T , n)|    = a f (T - T f- )| , к * I S l - к                         ^к - 1
Теплоноситель	Теплообменное устройство	u = 0	( - [ A ] grad T , n )| S - к = a f (T - T f )| S k - 1 , к * l

ВЫВОДЫ

Многообразие квалификационных признаков и соответственно вариантов исполнения свидетельствует не столько о разнообразии в процессах реализации полимеразной цепной реакции, а в основном об отсутствии общей методологии создания подобных устройств. Поэтому одной из целей являются обобщение накопленного в этой области опыта и разработка общей концепции создания амплификаторов ДНК. Созданные обобщенная структурная схема и концептуальная модель расчета амплификаторов ДНК являются основой для создания такой методологии.