Разработка ПЦР-тест системы для выявления вируса картофеля Y

Автор: Бессолицына Е.А., Тулинов А.Г., Новоселова Н.В., Харина А.В.

Журнал: Известия Коми научного центра УрО РАН @izvestia-komisc

Статья в выпуске: 7 (65), 2023 года.

Бесплатный доступ

Вирус картофеля Y поражает растения картофеля, нанося серьезный урон сельскому хозяйству за счет снижения урожайности данной культуры. Поэтому существует необходимость выявления данного возбудителя. Вирусы картофеля РНК-содержащие, поэтому могут быть использованы иммунологические методы или ПЦР, совмещенный с обратной транскрипцией. В ходе данной работы была разработана основа для ПЦР-тест системы для выявления вируса картофеля Y. Подобраны праймеры для реакции обратной транскрипции и последующей ПЦР, рассчитаны температуры отжига и размер амплифицируемого фрагмента. Проверены праймеры и условия реакции на растительном материале. Получены ПЦР-продукты рассчитанного размера. Определение их нуклеотидной последовательности подтвердило выявление генетического материала вируса картофеля Y. Таким образом, данная ПЦР-тест система может быть использована для выявления вируса картофеля Y.

Еще

Картофель, диагностика заболеваний, вирус y, праймеры, пцр-диагностика, пцр-тест система, обратная транскрипция

Короткий адрес: https://sciup.org/149144400

IDR: 149144400 | DOI: 10.19110/1994-5655-2023-7-5-11

Текст научной статьи Разработка ПЦР-тест системы для выявления вируса картофеля Y

В настоящее время известно 52 вида вирусов, поражающих картофель [1]. В Российской Федерации (далее – РФ) пять наиболее опасных видов: вирус картофеля Y (PVY), вирус картофеля X (PVX), вирус скручивания листьев (PLRV) и вироид веретеновидности клубней (PSTVd). Менее опасными, но при этом увеличивающими потери урожая при совместном заражении с другими вирусами, являются вирусы картофеля М и S (PVM и PVS соответственно) [2].

Вирус картофеля Y вызывает серьезные потери урожая картофеля (до 30 % и более в зависимости от времени воздействия, типа вируса, устойчивости сорта растения-хозя- ина), причем он поражает не только картофель, но и другие сельскохозяйственные культуры как в РФ, так и в других регионах планеты. Все эти факторы делают вирус картофеля Y экономически важным фитопатогеном [3, 4].

Вирус картофеля Y относится к роду Potyvirus, семейству Potiviridae. Вирусные частицы нитевидные, размер составляет 730×11 нм, осаждаются как единый компонент с коэффициентом седиментации около 150S [5]. Геном представлен одноцепочечной позитивной молекулой РНК, длина которой составляет 9.7 тыс. нуклеотидов, 5’-конец РНК ковалентно соединен 5’-концевым терминальным белком (Vpg), на 3’-конце располагается полиА-тракт [6]. Молекула РНК содержит 10 открытых рамок считывания, транслируемых одним полибелком [7].

Вирус картофеля Y передается при контакте поврежденных клубней, а также через семена. Другим агентом распространения вируса являются тли [8].

Симптомы заражения вирусом картофеля Y вариабельные и зависят от таких факторов, как штамм вируса, сорт и условия выращивания растения-хозяина. Может развиваться резкий некроз вдоль жилок, вплоть до полного отмирания листьев. Некроз может быть мозаичным, и сопровождаться морщинистостью листьев, которая может проявляться и без некротических изменений [9].

Множественность путей распространения вируса, вариабельность симптомов выявляют необходимость разработки достаточно быстрого, точного, чувствительного метода для выявления вируса как в организме растения-хозяина, так и в организмах переносчиков.

В настоящее время обычно используется метод имму-ноферментного анализа (далее – ИФА) – это высокоточный и высокочувствительный метод, но он достаточно дорог, и для него может быть использован только свежий материал [10]. Второй метод, активно используемый для выявления возбудителей заболеваний, – метод ПЦР, но его классический вариант нельзя применять, так как матрицей для ПЦР является молекула ДНК, а вирус картофеля Y (PVY) РНК-содержащий. Но существует модификация метода ПЦР – обратная транскрипция ПЦР (далее – ОТ-ПЦР), которая позволяет выявлять РНК различных возбудителей [там же]. Метод ОТ-ПЦР по себестоимости сопоставим с иммуноферментным анализом, но позволяет работать не только со свежим, но и фиксированным материалом.

Цель данной работы – разработка ПЦР-тест системы для выявления вируса картофеля Y в растительном ма- териале. Разработка включает в себя подбор структуры праймеров, условий реакции ОТ-ПЦР, анализ размера амплифицируе-

мого фрагмента, воспроизведение ОТ-ПЦР на растительном материале, определение нуклеотидной последовательности полу- ченного фрагмента, что является подтверждением того факта, что данная ПЦР-тест система выявляет именно наличие РНК вируса картофеля Y.

Материалы и методы

Последовательности геномов вируса картофеля Y (PVY) были скопированы из базы данных Genome, Nucleotide (www. . Названия последовательностей и их паспортные номера представлены в табл. 1.

Данные последовательности были проанализированы в программе AliBee - Multiple alignment Release 3.0 на сайте В выявленных консервативных участках отби- рали фрагменты 20–25 нуклеотидов, начинающиеся и заканчивающиеся на гуанин или цитозин (предполагаемые праймеры, представленные в табл. 2). Далее для праймеров проводился расчет температуры отжига по формуле:

Тотжига = (2×(количество аденина + тимина) + (1) 4×(количество гуанина + циозина)) – 5 .

Также в программе Nucleotide blast ( gov) проверялась уникальность праймеров и присваивался номер от 0 – последовательность не выявляется в нужных видах и генах, до 10 – последовательность выявляется только в геноме вируса и больше нигде.

Из табл. 1 были выбраны два уникальных праймера (уровень уникальности – от 8 и выше) с одинаковыми температурами отжига (допускаются различия температуры отжига до 2 оС), которые были синтезированы в фирме Синтол.

В качестве источника нуклеиновых кислот использовались пазушные почки клубня картофеля и покровная ткань вокруг них. Суммарные нуклеиновые кислоты выделялись с помощью модификации гуанидин-изотиоцианатного метода [11].

Реакцию обратной транскрипции проводили следующим образом: 50 нг РНК растворяли в 4 мкл воды, добавляли по 1 мкл обратного праймера в концентрации 40 рМ/мкл, прогревали при 95 оС 5 мин, затем добавляли 1 мкл 10Х буфера для обратной транскрипции, 1 мкл смеси dNTPs (концентрация 4 мкМ), 1 мкл обратной транскриптазы MMLV (15 е.а./мкл) (Сибэнзим) и деионизированную воду до 10 мкл. Полученную смесь инкубировали при 37 оС 1 ч 10 мин. Затем переосаждали и вносили на реакцию ПЦР: 2 мкл раствора матрицы после обратной транскрипции, 1 мкл буфера для ПЦР с 1.5 мМ MgCl2, 0.5 мкл смеси dNTPs

Таблица 1

Названия изолятов вируса картофеля Y (PVY) и их идентификационные номера в базе данных Genome, Nucleotide

Table 1

Names of Potato virus Y (PVY) isolates and their identification numbers in the database Genome, Nucleotide

№	Название	Идентификационный номер
1	Potato virus Y isolate May4B, complete genome	MK563993
2	Potato virus Y isolate Egypt35 polyprotein gene, complete	KY863551
3	Potato virus Y isolate Egypt7 polyprotein gene, complete cds	KY863549
4	Potato virus Y isolate Egypt11 polyprotein gene, complete cds	KY863548
5	Potato virus Y isolate VarB, complete genome	KT290512
6	Potato virus Y isolate VarA, complete genome	KT290511
7	Potato virus Y isolate GF_YL20, complete genome	KJ634023
8	Potato virus Y genomic RNA, complete genome, isolate: T13	AB714135
9	Potato virus Y isolate WWA150131_G4_8, complete genome	MT200673
10	Potato virus Y isolate MT12_Oth288, complete genome	MT200671
11	Potato virus Y isolate BL2, complete genome	MT200669
12	Potato virus Y strain N, complete genome	MT350290
13	Potato virus Y strain O, complete genome	MT350288
14	Potato virus Y isolate P097, complete genome	MT264732
15	Potato virus Y isolate PVYO_R3S16L8, complete genome	MK572844
16	Potato virus Y isolate PVYN_O_R3S2L8, complete genome	MK572835

(концентрация 4 мкМ), по 1 мкл праймеров, концентрация каждого 10 рМ/мкл, 0.75 мкл Taq-полимеразы (5 ед.а./мкл) (Сибэнзим) и деионизированную воду до 10 мкл. Реакция ПЦР состоит из трех этапов 1-й и 3-й состоят из одного цикла, так как не требуется циклическое изменение температуры. Продукты реакции амплификации разделяли в 6 %-ной нативном полиакриламидном геле, который окрашивался бромистым этидием [там же].

ПЦР-продукты экстрагировали из геля [там же] и определяли нуклеотидную последовательность в фирме Евроген. Полученные результаты сравнивали в программе Nucleotide blast ( с уже имеющимися

Последовательности, использованные для праймеров, их положение в геноме, длина, температура отжига и степень уникальности

Table 2

Sequences used for primers, their position in the genome, length, annealing temperature and degree of uniqueness

№	Вирус	Положение праймера	Последовательность	T, отжига , °С	Уникальность 0–10
1	PVY	2130 – 2157	GACATGTGTGTGCCAAAGCTTGGAACC	59	8
2	PVY	2140 – 2166	GTGCCAAAGCTTGGAACCTGGCCAAC	60	7
3	PVY	2220 – 2244	CATGATGCAGAACTGCCTAGAATA	52	7
4	PVY	2434 – 2457	ATATCACCTTTCAGAGAAGGAGG	52	9
5	PVY	2811 – 2835	GATGGTGTTGCAAGTTGTTAAGAA	50	7
6	PVY	2962 – 2983	GAAAAATTATCCGCAACATGG	47	7
7	PVY	3163 – 3189	AATATTTCATCCTTTTTCATTCGTAG	48	7
8	PVY	3683 – 3705	AGGGGAGCTGTTGGGTCTGGAA	57	7
9	PVY	4480 – 4503	GTTGATGGCAGAACAATGAAGCA	52	7
10	PVY	4948 – 4976	GATGGATCAATGCATCCTGTCATACATG	56	7
11	PVY	4959 – 4986	GCATCCTGTCATACATGACATTCTTAA	53	7
12	PVY	5323 – 5346	CAGAGCCAATTCAGAAGTCTCAT	52	7
13	PVY	5349 – 5377	GAAGGATGCTCAAGCATGTTTTCAATTG	55	7
14	PVY	5806 – 5833	GAATTCTTTGGATCTGCATACAGGAA	53	7
15	PVY	5857 – 5884	GTTGGTATGGGCAAGTCAAGCAGGAGG	60	7
16	PVY	6085 – 6111	TACTTCAGGAAAGATTGGTCTGACAA	53	8
17	PVY	7152 – 7175	TTCTTCAGGCCTTTGATGGATGC	53	7
18	PVY	7562 – 7586	GGACATTCACTGCTGCACCTTTAG	55	7
19	PVY	7804 – 7829	AGAAGCACATACATGGAAGATTGGG	54	7
20	PVY	7832 – 7857	TGGGGTTGCAAATGTTGCGCAATTT	54	7
21	PVY	7885 – 7908	TCAACTCCAGATGGAACAATTGT	50	7
22	PVY	8346 – 8374	CACCAAATCAGGAGATTCTACTCATGGT	56	7
23	PVY	8567 – 8591	ACACAATCGATGCAGGAGGAAGCA	55	8
24	PVY	8703 – 8730	GCTATCACGTCCAAAATGAGAATGCCC	57	8
25	PVY	8812 – 8839	GCAACTCAATCACAGTTTGATACGTGG	56	7
26	PVY	8900 – 8927	GGCTTATGGTTTGGTGCATTGAAAATG	54	7
27	PVY	8907 – 8935	GGTTTGGTGCATTGAAAATGGAACCTCG	58	8
28	PVY	8942 – 8969	CAACGGAGTTTGGGTTATGATGGATGG	57	9
29	PVY	8992 – 9019	TGAAACCAATCGTTGAGAATGCAAAAC	53	8
30	PVY	9025 – 9051	CTTAGGCAAATCATGGCACATTTCTC	54	8
31	PVY	9038 – 9065	TGGCACATTTCTCAGATGTTGCAGAAG	56	8,5
32	PVY	9051 – 9079	GATGTTGCAGAAGCGTATATAGAAATGC	55	8
33	PVY	9080 – 9108	GCAACAAAAAGGAACCATATATGCCACG	56	8
34	PVY	9094 – 9118	CCATATATGCCACGATATGGTTTA	50	8
35	PVY	9208 – 9231	CACATTCAAATGAAGGCCGCAGC	55	8
36	PVY	9272 – 9300	AACACAGAGAGGCACACCACCGAGGATG	62	8
37	PVY	9322 – 9351	TCTCCAAGTATGCATACTCTACTTGGAGT	56	8,5

в них последовательностями генома различных изолятов вируса картофеля Y.

Результаты и их обсуждение

Вирус картофеля Y имеет белковый капсид, протеоме-ры которого могут быть использованы для детекции вируса в растительных тканях методом иммуноферментного анализа, однако этот метод достаточно дорог. Метод ПЦР дешевле, при этом имеет сопоставимые чувствительность и точность. Но геном вируса представлен молекулой РНК. Данная молекула не может быть матрицей для стандартного метода ПЦР. Поэтому был выбран метод обратной Таблица 2 транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией.

Для выявления РНК вируса PVY необходимо разработать праймеры. Для этого в базе данных ( gov) было выбрано 16 последовательностей полных геномов различных изолятов вируса картофеля Y. Последовательности полных геномов использовали для большей простоты выравнивания и получения максимального количества фрагментов последовательности РНК вируса, которые можно было бы использовать в качестве праймеров.

Названия изолятов и их номера в базе данных представлены в табл. 1.

Так как геном вируса представляет собой мРНК (+ цепь РНК), кодирующую один полибелок, который транслируется, а затем разрезается на отдельные субъединицы, выбор открытых рамок считывания, кодирующих отдельный белок, не производился, а анализу подвергались нуклеотидные последовательности всего генома.

Далее последовательности были проанализированы в программе AliBee - Multiple alignment Release 3.0 на сайте В результате сравнения последовательностей выявлены идентичные у всех исследованных изолятов участки геномов, в которых выбирали последовательности для будущих праймеров. Последовательности для праймеров должны быть длиной 20–25 нуклеотидов, начинаться и заканчиваться на гуанин или цитозин.

Затем с помощью формулы (1) были рассчитаны температуры отжига, а также посчитано количество нуклеотидов во всех фрагментах. Далее в программе Nucleotide blast ( проверяли уникальность праймеров. Для этого сравнивали исследуемую последовательность с уже имеющимися в базе. В зависимости от уникальности исследу- емым последовательностям присваивалось значение уникальности от 10 (обнаруживается только в геномах различных изолятов вируса картофеля Y) до 0 (не обнаруживается в геномах PVY, но выявляется в геномах других организмов).

Последовательности и их положение в геноме, температура отжига, количество нуклеотидов и его уникальность представлены в табл. 2.

Наибольшей степенью уникальности обладают фрагменты под №№ 28 (уникальность – 9), 31 и 37 (уникальность – 8.5), но у фрагмента № 28 температура отжига составила 57 °С. Фрагменты №№ 31 и 37 имеют одинаковую температуру отжига (56 °С). Поскольку в температурах отжига допускается различие до 2 °С, все три фрагмента могут быть использованы в качестве праймеров, но также необходимо учитывать размер ПЦР-продукта. Оптимальным для разделения с помощью гель-электрофореза в полиакриламидном геле являются фрагменты ДНК длиной от 150 до 300 пар нуклеотидов. Фрагменты №№ 28 и 31 будут образовывать ПЦР-продукт длиной 158 пар нуклеотидов, такая длина ближе к нижней границе оптимума. Пары фрагментов №№ 28/37 и №№ 31/37 будут образовывать фрагменты длиной 451 и 313 пар нуклеотидов. Соответственно, такие фрагменты длиннее оптимальных.

Поэтому были рассмотрены фрагменты с №№ 32 по 36, их уникальность составила 8. По температуре отжига совпал фрагмент № 33, у остальных температура отжига не совпадает больше допустимых различий. Определение длины ПЦР-продукта показало, что для пары №№ 33 и 37 она будет составлять 271 пару нуклеотидов, которая попадает в пределы оптимальных длин фрагмента.

Следует отметить, что фрагмент № 4 (уникальность – 9) не рассматривался в связи с далеким расположением от фрагмента № 28, с вероятностью не получить ампликон обычными методами и низкой уникальностью соседнерасположенных фрагментов.

Таким образом, последовательности №№ 33 и 37 были использованы для создания праймеров.

Как видно из результатов гель-электрофореза, положительный результат выявлен в образце № 1. В дорожке 1 видна единственная четкая полоса чуть ниже полосы маркера длиной 300 пар нуклеотидов. Также слабо светящаяся полоса на том же уровне присутствует в дорожке 6 (образец картофеля № 6). Наличие полос означает, что праймеры провзаимодействовали с матрицей, а размер полученного фрагмента ДНК соответствует ожидаемому. Эти факты позволяют предполагать, что в образцах картофеля №№ 1 и 6 присутствует РНК вируса PVY. Тогда как в других образцах вирус отсутствует. Отсутствие дополнительных полос на дорожках 1 и 6 указывает на то, что праймеры отжигаются только на одном участке в образце нуклеиновых кислот, что подтверждает высокую степень уникальности, которая была определена теоретически. Отсутствие одинаковых полос во всех образцах подтверждает отсутствие реакции праймеров с РНК хозяина, а также их уникальность.

Кроме того, задачей являлась оценка возможности использовать данные праймеры в существующих условиях реакции ПЦР для выявления вируса картофеля Y.

Так как положительный контроль – образец ткани картофеля, зараженного вирусом Y, отсутствовал, проверку того, что данный амплифицированный фрагмент и есть ДНК-копия генома вируса картофеля Y, проводили, определяя нуклеотидную последовательность полученного ПЦР-продукта.

Образец РНК № 1 использовали для получения ПЦР-про-дукта, который был очищен и отправлен на определение нуклеотидной последовательности в фирму Евроген.

Таблица 3

Последовательность праймеров для выявления вируса картофеля Y (PVY)

Table 3

Potato virus Y (PVY) primer sequence

Название праймера	Последовательность праймера	T, отжига , °С	Размер ПЦР-продукта
PVY 1 F	5’ - GCAACAAAAAGGAACCATATATGCCACG - 3’	56	271 п.н.
PVY 1 R	5’ - ACTCCAAGTAGAGTATGCATACTTGGAGA - 3’	56	271 п.н.

Название и последовательность, температура отжига праймеров представлены в табл. 3, а также предполагаемый размер ПЦР-продукта, рассчитанный по последовательности генома вируса.

Праймеры после обработки были заказаны в фирме Синтол. Далее проводилась проверка работы праймеров в реальных условиях. Для анализа использованы образцы пазушных почек клубней картофеля, так как растущие ткани более пригодны для выделения нуклеиновых кислот как ткани с меньшим размером клеточных стенок и большим объемом генетического материала. Клубни были предоставлены с фермерского поля в Куменском районе Кировской области.

Выбрано восемь клубней с прорастающими пазушными почками, из которых брался материал для обратной транскрипции и ПЦР. Продукты реакции визуализировали методом электрофореза в нативном полиакриламидном геле. Полученный результат представлен на рис. 1.

Рисунок 1. Гель-электрофорез в 6 %-ном нативном полиакриламидном геле, продуктов реакции ОТ-ПЦР на наличие вируса PVY. Дорожки 1–8 – реакции с образцами картофеля №№ 1–8; № 9 – отрицательный контроль; М – маркер длин фрагментов ДНК (Сибэнзим). Ожидаемый размер ПЦР-продукта PVY – 271 п.н.

Figure 1. Gel electrophoresis in 6 % native polyacrylamide gel of the RT-PCR reaction products for the presence of PVY. Lanes 1–8 – reactions with potato samples № 1 – № 8; № 9 – negative control; M – marker of DNA fragment lengths (Sibenzyme). The expected size of the PVY PCR product is 271 bp.

Получена следующая последовательность нуклеотидов: TGGCATTCTCATTTTGGACGTGATAGCTAAGCCTAAATATGCAA TGCAGGGATATTTACAATTTTTTATAAAAACACCCAGACCAAAACA AGTATCAACAGTCTGCTTCCTCCTGCATCGATTGTGTCA.

Она короче, чем размер ПЦР-продукта, так как секвенирование ПЦР-продуктов затруднено, поэтому в текстовый редактор переведен только тот участок, в котором были наиболее точные результаты капиллярного гель-электро-фореза.

Полученная последовательность проанализирована в Nucleotide blast (. Результаты представлены на рис. 2.

□ Potato virus Y strain 0 g ene for coat protein , partial cds	PotatovirusYstralnO	60,2	60.2	23%	6e-05	100.00%	799	10340445.1
Q Potato virus Y isolate PVY-CJ ooly protein ч епе , complete cds	Potato virus Y	60.2	60,2	23%	6e-05	100.00%	9614	KY6Q0342 1
Q Potato virus y isolate WG015 2Ю polv protein g ene , complete cds	Potato virus Y	60.2	60.2	23%	6^05	100.00%	9653	MF624291 1
Q Potato virus Y Is ola te WQQ15 204 RBteoteln gens. ЕОПЩе cd s	Potato Y lrys Y	Ы) 7	fin 2	23%	Re-QR	100,00%	U64II	MF624290 I
Q Potato virus Y isolate WGO1S 201 p olv protein g ene, complete cds	Potato virus Y	fifi 9	60 2	93%	Кя-Пб	100,00%	9633	MF624289.1
Q Potato virus Y Isolate Qth2016 153 polv protein g ene , complete cds	Potato virus Y	60.2	60.2	23%	6e-05	100.00%	9655	MF624268.1
Q Potato virus Y isolate Yunnan 1 coat protein g ene , partial cds	Potato virus Y	60.2	60.2	23%	6e-05	100.00%	801	KJ513434.1
Q Potato virus Y Isolate Guizhou 2 coat protein g ene , partial cds	Potato virus Y	60.2	60.2	23%	6e-05	100.00%	801	KJ513425.1
Q Potato virus Y Isolate Gulzhou_1 coat protein g ene , partial cds	Potato virus Y	60.2	60.2	23%	6e-05	100.00%	801	KJ513423.1
Q Potato virus Y isolate WI120018. complete g enome	Potato virus Y	60.2	60.2	23%	6e-05	100.00%	9609	KY848028.1
Q Potato virus Y isolate WA316. complete g enome	Potato virus Y	60.2	60.2	23%	6e-05	100.00%	9571	KY848025.1
Q Potato virus Y isolate SU2 . ,complete g enome	Potato virus Y	60.2	60.2	23%	6e-05	100.00%	9655	К Y848024.1
Pvlutu Virus V isulsle ND 100040 uvmuleto ueriuiue	Potato virus Y					100.00%		К Y847992.1
0 Potato virus Y isolate ID26 . complete genome	Potato virus Y	en 9	60 7	93%	Ra-ПП	100.00%	germ	KYM7955.1
Q Potato virus Y isolate 1021 . complete g enome	Potato virus Y	60.2	60.2	23%	6e-05	100.00%	9676	К Y64 7954,1
Q Potato virus Y isolate ID13_6l0Brw . complete genome Q Potato virus Y Isolate ID1280, complete genome	Potato virus Y Potato virus Y		60.2		бе-05	100.00% 100.00%	9605	KY847953.1 KY847951.1
Q Potato virus Y Isolate Xch-Wh nonfuncbOnal PIPO and nonfunctional polyprotein genes, complete segue..	. Potato virus Y				tie-OD	100.00%		I ( Л.1- J ]
Q Potato virus Y Isolate ZLT-2012H Y coat protein mRNA , partial cds	Potato virus Y	60.2	602	23%	6e-05	100.00%	801	KU893142.1
Я Potato virus Y strain PVY-NE11 polvprotein gene, complete cds	Potato virus Y	fin 9	fifl 7	93%	Rn.nh	100.00%	дЛЗЙ	KP793716.1
Q Potato virus Y Isolate 1021 coat protein g ene , partial cds	Potato virus Y	60.2	60.2	23%	6e-05	100.00%	801	KJ741190.1
Я Potato virus Y Isolate CN:XT27:16 coat protein gene, partial cds	Potato virus Y	60.2	60 2	23%	6e-05	100.00%	801	MH054516.1

Рисунок 2. Результаты проверки нуклеотидной последовательности в Nucleotide blast ( gov).

Figure 2. Results of verification of the nucleotide sequence in Nucleotide blast (. 1

Как видно из результатов сравнения последовательности с последовательностями из базы данных генов в Nucleotide blast (, исследуемая последовательность на 100 % совпадает с последовательностью генома вируса картофеля Y (PVY). Соответственно, данная пара праймеров в выбранных условиях обеспечивает амплификацию с матрицы РНК PVY и может быть использована как пара праймеров для ПЦР-тест системы для выявления вируса картофеля Y.

Данная система апробирована с использованием материалов, предоставленных Институтом агробиотехнологий ФИЦ Коми НЦ УрО РАН (Республика Коми, г. Сыктывкар). Проанализировано 48 клубней картофеля по окончании периода зимней лежкости в хранилище Института. Клубни отобраны от 16 селекционных сортообразцов питомников предварительного, основного и конкурсного испытаний по три клубня от каждого номера. В данном случае повторность не учитывалась, так как клубни были выкопаны с разных участков полей и не могли быть перезаражены через насекомых или какие-либо микромеханические повреждения. Поэтому можно было анализировать клубни как отдельных представителей, возможно, зараженные патогеном. Из 48 образцов зараженными оказались восемь, т.е. процент общей зараженности составил 16.7 %. Только в одном сортообразце отмечено заражение двух клубней из трех, в остальных же случаях заражен был только один клубень из трех. Можно предположить, что, с одной стороны, это показывает, что механические микроповреждения, получаемые клубнями в ходе уборки копателем и контактом с его рабочим органом, обеспечивают непосредственно перенос патогена, так как сами клубни не контактировали и находились на разных участках полей, а с другой – заражение произошло в ходе контакта уже непосредственно во время закладки в лечебный период и при последующем зимнем хранении. Таким образом, данная аналитическая система требует дальнейшей проверки с подбором материала.

Заключение

Разработана ПЦР-тест система для выявления генетического материала вируса картофеля Y. По результату анализа генома подобраны праймеры, апробированные в условиях реакции. Таким образом, праймеры PVY 1 F и PVY 1 R готовы для разработки тест-системы для выявления материала вируса PVY. Так же были подобраны условия реакции, и за счет определения нуклеотидной последовательности подтверждена достоверность реакции.

Список литературы Разработка ПЦР-тест системы для выявления вируса картофеля Y

Kreuze, J. F. Viral diseases in potato / J. F. Kreuze, J. A. C. Souza-Dias, A. Jeevalatha, A. R. Figueira, J. P. T. Valkonen, R. A. C. Jones // The Potato Crop. – Cham: Springer, 2020. – P. 389–429.
Рогозина, Е. В. Широко распространенные и потенциально опасные для Российского агропроизводства возбудители вирусных болезней картофеля / Е. В. Рогозина, Н. В. Мироненко, О. С. Афанасенко, Ю. Мацухито // Вестник защиты растений. – 2016. – № 4 (90). – С. 24–33.
Kerlan, C. Potato virus Y. – URL: https://dpvweb.net/dpv/showdpv/?dpvno=414.
Lacomme, C. General characteristics of potato virus Y (PVY) and its impact on potato production: an overview / C. Lacomme, L. Glais, D. Bellstedt, B. Dupuis, A. Karasev, E. Jacquot // Potato virus Y: biodiversity, pathogenicity, epidemiology and management. – Cham: Springer, 2017. – P. 1–19.
Baunoch, D.A. Potato virus Y helper component is associated with amorphous inclusions / D.A. Baunoch, P. Das, V. Hari // Journal of General Virology. – 1990. – Vol. 71(10). – P. 2479–2482. doi:10.1099/0022-1317-71-10-2479.
Chung, Betty Y.-W. An overlapping essential gene in the Potyviridae / Betty Y.-W. Chung, W. Allen Miller, John F. Atkins, Andrew E. Firth // PNAS. – 2008. – Vol. 105(15). – P. 5897–5902. doi:10.1073/pnas.0800468105.
Kneller, E.L. Cap-independent translation of plant viral RNAs / E.L. Kneller, A.M. Rakotondrafara, W.A. Miller // Virus Research. – 2006. – Vol. 119(1). – P. 63–75. doi: 10.1016/j.virusres.2005.10.010.
Сухорученко, Г. И. Система интегрированной защиты репродукционного семенного картофеля от комплекса вредных организмов в Северо-Западном регионе Российской Федерации / Г. И. Сухорученко, Г. П. Иванова, С. А. Волгарев. – Санкт-Петербург: Пушкин, 2016. – 64 с.
Galvino-Costa, S. B. F. Molecular and serological typing of potato virus Y isolates from Brazil reveals a diverse set of recombinant strains / S. B. F. Galvino-Costa, A. R. Figueira, F. A. C. Rabelo-Filho, F. H. R. Moraes, O. V. Nikolaeva, A. V. Karasev // Plant Disease. – 2012. – Vol. 96(10). – P. 1451–1458. doi: 10.1094/PDIS-02-12-0163-RE.
Onozuka, N. One-step real-time multiplex reverse transcription- polymerase chain reaction assay with melt curve analysis for detection of potato leafroll virus, potato virus S, potato virus X, and potato virus Y / N. Onozuka, T. Ohki, N. Oka, T. Maoka // Virology Journal. – 2021. – Vol. 18. – № 131. doi: 10.1186/s12985-021-01591-3.
Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, T. Fritch, T. Maniatis. – New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. – 1659 p.

Еще

Статья научная