Разработка протокола введения растений земляники в культуру in vitro

Вве^ение. Земляника садовая является одной из наиболее экономически значимых культур в современном ягодоводстве. Мировой объем производства ягод земляники увеличился до 9,1 млн. тонн на фоне увеличения посадочных площадей до 0,4 млн. га. Освоение современных технологий производства плодов и ягод невозмо^но без развития питомниководства, обеспечивающего стабильность и конкурентноспособность отрасли садоводства в целом [1]. Основными приемами интенсивной технологии возделывания земляники садовой является подбор высокопродуктивных сортов и выращивание оздоровленного от комплекса патогенов посадочного материала, что способствует повышению продуктивности агроценозов земляники в 3-5 раз и существенно сни^ает инвестиционные риски [2]. Россия довольно активно импортирует рассаду земляники, ввоз по данным статистики в 2018 году составил 17,7 млн. шт., что связано с недостатком собственного посадочного материала при росте площадей закладываемых земляничных плантаций.

Одним из путей значительного увеличения производства рассады земляники является микроклональное размно^ение, которое так^е способствует освобо^дению от болезней и вирусов. Ценность такого посадочного материала неизмеримо выше, чем вегетативно размно^аемого. Маточные и промышленные наса^дения, зало^енные базисным и сертифицированным посадочным материалом, максимально реализуют свой генетический потенциал по сравнению с рядовым посадочным материалом [3]. Затраты, связанные с оздоровлением и доращиванием розеток, быстро окупаются за счет повышения выхода и качества рассады, а при закладке плодоносящих плантаций – за счет прибавки уро^ая [4].

В то ^е время, метод культуры тканей считается длительным и дорогостоящим. Несмотря на высокую эффективность, он требует для оздоровления сортов не менее 2,5 лет и значительных материальных затрат [5]. Поэтому актуальна разработка эффективных и воспроизводимых систем регенерации растений в системе in vitro.

Первичная культура in vitro определяет весь последующий технологический цикл клонального микроразмно^ения. Одними из основных факторов, влияющими на эффективность инициации культуры in vitro и ее дальнейшую стабилизацию, мо^но выделить: период изоляции меристем, сортовые особенности и тип стерилизующего агента.

Целью иссле^ований была разработка эффективного протокола введения эксплантов земляники для ускоренного размно^ения в системе in vitro.

Услови^, материалы и мето^ы. Исследования проводили на базе лаборатории биотехнологии ФГБНУ ВНИИСПК в 2017-2019 гг. В качестве растительных объектов были выбраны наиболее востребованные сорта земляники садовой различного эколого-географического происхо^дения: Флоренс (Florence), ^зия (Asia), Хоней (Honeoye), Дарселект (Darselect), Кимберли (Kimberly), Фрида (Frida), Мармелада (Marmolada), Берегиня, Царица, Уро^айная ЦГЛ.

Исследовали три срока введения земляники в культуру: начало роста (февраль), активный рост (июнь), затухание роста (август). Исходным материалом для летних сроков введения слу^или розетки, заготовленные с вегетирующих растений непосредственно перед введением. В отличие от других плодовых и ягодных растений земляника не имеет ярко выра^енного периода покоя, что мо^но использовать для нетрадиционной зимней изоляции эксплантов в культуру in vitro . Для зимнего введения розетки заготавливались в конце октября и после предварительной подготовки хранились в пластиковых пакетах в холодильной камере при температуре +1-+2ºС. Введение в культуру проводили с первыми признаками возобновления роста (выдви^ением центрального листа и образованием молодых корешков).

Лабораторные исследования проводили по существующим методическим рекомендациям [6, 7].

В качестве стерилизующих агентов использовали мертиолят в концентрации 0,01% и сулему – 0,1% с экспозицией 10 минут. После стерилизации растительный материал три^ды промывали стерильной дистиллированной водой. Для снятия фенольного окисления питательной среды и эксплантов проводили замачивание стерильного материала земляники в 0,3 % стерильном растворе аскорбиновой кислоты на весь период изоляции.

На этапе введения экспланты культивировали на среде Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962), дополненной 6-бензиламинопурином (Б^П) – 0,5 мг/л.

Собственно микроразмно^ение проходило на питательной среде Мурасиге-Скуга на фоне 6-Б^П 0,8 мг/л.

Культивировали экспланты при температуре 23 ± 1⁰C, освещенности 2 тыс. люкс и фотопериоде 16 ч день/ 8 ч ночь.

Результаты и обсуждение. Основными факторами эффективного введения в культуру in vitro растительных объектов являются тип стерилизующего вещества и время обработки, сортовые особенности растения, возраст и качество растительного материала, сезон проведения работ. Полная стерильность растительного материала и быстрая стабилизация ростовых процессов – необходимые условия нормального развития эксплантов в культуре in vitro .

По результатам исследований, наибольшее количество стерильных эксплантов земляники было получено при обработке 0,1% раствором сулемы (табл. 1).

Таблица 1 – Влияние типа стерилизатора на выход стерильных ^изнеспособных эксплантов земляники, 2017-2019 гг., %

Показатели введения	Начало роста (февраль)		^ктивный рост (июнь)		Затухание роста (август)
	мертиолят	сулема	мертиолят	сулема	мертиолят	сулема
Контаминация	18,1	11,6	14,8	4,0	12,0	7,6
Некроз	23,5	13,9	13,4	16,0	19,8	11,7
Жизнеспособность	58,4	74,8	71,8	80,0	68,2	80,7

Доля ^изнеспособных эксплантов сни^алась в основном за счет некроза растительных тканей у части объектов. При этом экспланты всех сроков введения при обработке 0,1% раствором сулемы отличались более высокой ^изнеспособностью и меньшей контаминацией, чем при обработке 0,01% раствором мертиолята. В среднем по сортам было получено 74,8-80,7% ^изнеспособных эксплантов (табл. 2). На начальном этапе в среднем по сортам отмечали высокую при^иваемость эксплантов независимо от срока введения в культуру. В то ^е время, отмечали существенное влияние генотипа (сортовых особенностей) на показатели при^иваемости эксплантов.

Таблица 2 – Результативность введения земляники в культуру in vitro , 2017-2019 гг., %

Сорт	Показатели	Срок введения
		февраль	июнь	август
Флоренс	контаминация	3,5	21,0	11,5
	некроз	11,2	13,0	13,5
	^изнеспособность	85,3	66,0	75,0
Хоней	контаминация	9,0	4,4	6,0
	некроз	10,8	26,9	6,0
	^изнеспособность	82,2	68,7	88,0
Дарселект	контаминация	20,3	0,0	2,0
	некроз	21,9	4,0	7,0
	^изнеспособность	57,8	96,0	91,0
^зия	контаминация	6,9	14,7	9,0
	некроз	6,9	7,3	10,5
	^изнеспособность	86,2	78,0	80,5
Кимберли	контаминация	16,0	2,0	5,5
	некроз	16,0	36,0	12,5
	^изнеспособность	68,0	62,0	82,0
Берегиня	контаминация	14,0	2,0	12,0
	некроз	4,0	36,0	23,0
	^изнеспособность	82,0	62,0	65,0
Фрида	контаминация	15,4	8,0	5,5
	некроз	35,9	16,0	6,0
	^изнеспособность	48,7	76,0	88,5
Мармелада	контаминация	18,6	9,4	4,5
	некроз	16,3	15,1	9,0
	^изнеспособность	75,1	75,5	86,5
Царица	контаминация	9,6	0,0	7,0
	некроз	8,1	17,0	9,5
	^изнеспособность	82,3	83,0	83,5
Уро^айная ЦГЛ	контаминация	6,6	4,0	13,0
	некроз	11,2	16,0	19,5
	^изнеспособность	82,2	80,0	67,5
В среднем по сортам	контаминация	12,0	4,0	7,6
	некроз	14,2	16,0	11,7
	^изнеспособность	74,8	80,0	80,7

Проведенные исследования показали различную регенерационную активность эксплантов, изолированных в разные сроки вегетации: февраль – начало роста после хранения, июнь – активный рост, август – сни^ение ростовой активности. Скорость инициации меристематической ткани, приводящей к образованию из нее целых растений, зависит от темпов ее дифференциации. В то ^е время, количество эксплантов, пригодных к клонированию, не зависело от общего уровня регенерации. Стабилизация культуры при зимнем введении проходила значительно быстрее, чем в другие сроки. (табл. 3).

Таблица 3 – Регенерационная способность меристематических верхушек земляники

Срок введения	Регенерировало через 2 месяца, %		Средний балл развития
	всего	образовало розетку
февраль	75,8	75,2	4,2
июнь	80,0	39,5	2,6
август	80,7	28,9	2,2

При зимнем сроке введения через два месяца образовало розетку в среднем по сортам 75,2% введенных эксплантов. Микророзетки были интенсивно зелеными, хорошо развитыми, с 2-3-мя листьями (рис.).

а                       б                           в

Рисунок – Регенерационная способность микрорастений земляники при различных сроках введения: а) февраль, б) июнь, в) август

Средний балл развития составил 4,2 балла из 5. В летние сроки, несмотря на высокий выход стерильных эксплантов, к дальнейшему клонированию было пригодно лишь 28,9-39,5% эксплантов, введенных в культуру. Средний балл развития не превышал 2,6 балла. Коэффициент размно^ения в культуре in vitro в значительной мере определяется генотипом растений (табл. 4).

Таблица 4 – Высота растений и коэффициент размно^ения сортов земляники, 1-ый пасса^

Сорта	Февраль		Июнь		^вгуст
	5 го -н О S о X Л Ф m<3 го CL	х к н П ™ ф X III го 2 Ь	5 ГО - го CL	t of н Ф X ill го н § аз	5 Го - О S го CL	t н X ill го н § аз
Царица	10,3±0,6	1,4±0,1	6,0±0,3	0,0	6,0±0,2	0,0
Флоренс	8,8±0,6	2,3±0,4	5,2±0,7	2,8±0,3	7,0±0,7	0,0
^зия	10,7±0,6	1,6±0,1	9,0±0,3	3,5±0,3	6,8±0,5	0,0
Уро^айная ЦГЛ	12,0±0,8	1,5±0,2	9,0±0,3	1,3±0,2	6,0±0,6	1,1±0,2

Максимальную регенерационную способность в первом пасса^е микроразмно^ения отмечали у сорта Флоренс зимнего и раннелетнего сроков введения (2,3 и 2,8 шт./эксплант) и сорта ^зия раннелетнего срока введения (3,5 шт./эксплант). На первых этапах микроразмно^ения не образовали дополнительных розеток экспланты сортов Царица, Флоренс, ^зия позднелетнего срока введения.

Таким образом, изменения в темпах роста и развития сортов на первых этапах микроразмно^ения зависели не только от генотипических особенностей, но и от времени изоляции. У микрорастений зимнего срока у^е через три месяца после введения наблюдали не только пролиферацию, но и спонтанное образование корней. Растения имели хорошо развитую корневую систему и были пригодны к пересадке в нестерильные условия.

Выво^ы . Максимальный процент при^иваемости эксплантов был получен при поверхностной стерилизации 0,1% раствором сулемы. На первом этапе микроразмно^ения экспланты имели высокую ^изнеспособность во все сроки изоляции, при^иваемость составила 74,8-80,7%. Использование зимнего срока изоляции эксплантов земляники позволило повысить выход эксплантов, способных к дальнейшему клонированию, ускорить стабилизацию культуры in vitro и сократить сроки получения микрорастений, пригодных для высадки в нестерильные условия. В среднем по сортам было получено 75,2% эксплантов, способных к дальнейшему клонированию.

Tolstoguzova [i dr.] // Plodovodstvo i yagodovodstvo Rossii. 2010. T.24. № 2. S. 119-126.