Разработка способа стандартизации иммунотерапевтических препаратов на основе белка теплового шока HSP70

Актуальность. Одним из наиболее перспективных и динамично развивающихся методов терапии злокачественных новообразований является иммунотерапия. Предотвращение метастазирования и уменьшение размеров опухоли достигается в основном за счет двух типов эффекторных клеток – цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и нормальных киллерных клеток (НК). Индукция ЦТЛ, специфичных к антигенам опухоли, возможна при участии антиген-презентирующих клеток (АПК), предварительно нагруженных соответствующим опухолевым антигеном. Белок теплового шока hsp70 является мощным средством доставки антигенных пептидов в АПК, стимулирующим кросс-презентацию этих антигенов и созревание АПК. В отличие от РНК и ДНК-вакцин препараты hsp70 способны активировать НК, отвечающие за деструкцию клеток, не экспрессирующих молекулы MHC-I класса на поверхности мембраны, чем часто характеризуются клетки злокачественных новообразований. Эффективность препаратов hsp70 определяется содержанием комплексов с антигенными пептидами. Увеличение содержания комплексов с пептидами в препарате hsp70 повышает эффективность индукции ЦТЛ. С другой стороны, конформационные изменения, происходящие с белком при образовании комплексов, могут снижать эффективность активации им НК. Поэтому определение оптимального содержания комплексов с антигенными пептидами и разработка метода стандартизации препаратов на основе hsp70 представляют собой одну из важнейших задач, которые необходимо решить перед внедрением методов иммунотерапии с использованием hsp70 в клиническую практику.

Цель исследования. На основе экспериментальных данных о функционировании hsp70 in vitro предложить способ стандартизации препарата на основе его комплексов с пептидами.

Материал и методы. Объектом исследования являлись рекомбинантный HSP70A1B человека и его гибридный аналог, полученные стандартными методами генной инженерии и биотехнологии. АТР-азная активность белка (нмоль/мг×мин) определялась колориметрическим методом по количеству образовавшегося фосфата. Связывание с меченым пептидом (% связавшегося белка) определялось колориметрическим методом по поглощению метки. Статистичекий анализ данных проводился с помощью ПО Statistica 7.0 и Origin Pro 7.5.

Результаты. З ависимость АТР-азной активности препаратов HSP70A1B и его гибридного аналога от процентного содержания в них комплексов с пептидом носила линейный характер и не зависела от структуры пептида (p<0,05). Угловой коэффициент прямой, отражающей данную зависимость, различался для HSP70A1B и его гибридного аналога.

Выводы. На основе полученных экспериментальных данных можно утверждать, что АТР-азная активность препарата hsp70 является следствием образования комплексов данного белка с пептидами. Определение величины АТР-азной активности может быть предложено в качестве способа стандартизации препаратов на основе комплексов hsp70 с антигенными пептидами. Описанный нами способ стандартизации является в настоящее время единственным способом количественной оценки связанных с hsp70 немеченых пептидов.