Разработка способов повышения эффективности химиотерапии на основе малых интерферирующих РНК

Описанное около 15 лет назад явление РНК интерференции приобретает в настоящее время все более широкое применение в биомедицине. Сущность этого механизма заключается в существовании внутриклеточного механизма, регулирующего уровень экспрессии большинства генов посредством экспрессии малых интерферирующих РНК (иРНК), комплиментарных мРНК данных генов. Малые РНК представляют собой короткие одноцепочечные молекулы, которые включаются в белковый комплекс RISC (RNA-induced silencing complex), в составе которого взаимодействуют с мРНК - «мишенями». Эти события приводят к подавлению экспрессии (сайленсингу/нокдауну) соответствующего гена. После того, как Крейг Мелло и Эндрю Файер в 1998 году показали возможность активации данного механизма in vitro посредством экзогенных антисмысловых РНК, данное направление сразу получило широкое распространение в экспериментальной биологии. Экзогенная РНК интерференция стала удобным методом для целого ряда исследований - таких, как изучение взаимодействия молекул в сигнальных путях, изучение механизмов дефицита белка, путем направленного выключения его экспрессии, выявление потенциальных генов-мишеней, подавление экспрессии которых может приводить к ингибированию патологических процессов и т.д. Использование иРНК, которые эффективно ингибируют синтез генов, может оказаться весьма перспективным для создания новых противоопухолевых терапевтических конструкций.

ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ РНК И ЛЕКАРСТВЕННАЯ ТАРГЕТНАЯ ТЕРАПИЯ

Таргетная терапия в онкологии в настоящее время уже активно используется на практике, разрабатываются схемы лечения с включением таргетных препаратов. За последние два десятилетия выявлено несколько десятков потенциальных мишеней для раковых заболеваний, в то время как крупные коммерческие корпорации, такие как Roche, Novartis, Bayer, Astra Zenekа и др. обладают внушительным набором таргетных препаратов, постепенно реализуемых на рынке. Терапевтические мишени представлены достаточно широким спектром белков различных семейств, которые тем или иным способом вовлечены в процессы онкогенеза, такие как: тирозиновые киназы (ABL в составе химерного Bcr-Abl гена при хроническом миелобластном лейкозе ^ препарат Gleevek/Imatinib/SΤΙ^571); рецепторы к факторам роста (препараты Gefinib, Erlotinib, Cetuximab, ингибирующие работу рецептора эпидермального фактора роста; Араtinib ^ сeлeк-тивный ингибитор VEGF2, а такжe моноклональ-ноe антитeло бeвацизумаб, блокирующee фактор роста эндотeлия сосудов при ракe толстой кишки, легких и молочной железы; Тrastuzumab ^ моноклональное антитело к рецептору HER2 ^ при раке молочной железы); белки из системы репарации ДНК (PARР ингибитор Іniparib, PARP); ͷʜгибиторы апоптоза (ABТ-737 ^ против Bcl-xL и Bcl-w при лимфоме); JAK1,2,3 киназы (Lestaurtinib ^ против ЈАΚ2, при остром миелолейкозе) и некоторые другие.

Какие же преимущества по сравнению с моноклонами и малыми молекулами представляют макромолекулы ^ интерферирующие РНК?

В качестве аналогов разрабатываемого средства могут быть рассмотрены имеющиеся препараты для таргетной терапии. В своем большинстве такие препараты являются антителами к белкам, кодируемым генами. Такие антитела являются инородными для организма веществами, имеют неполную специфичность и обладают большими размерами, затрудняющими их доставку к белку-мишени. Указанные свойства приводят к значительным побочным эффектам и недостаточной эффективности имеющихся тар-гетных препаратов. В противоположность этому, иРНК ^ природные вещества, функционирующие в клетках человека (и других млекопитающих). Искусственно введенные иРНК не будут инородными для организма веществами. Как природные, так и синтезированные иРНК, обладают абсолютной специфичностью, позволяющей воздействовать именно на те гены, функция которых должна быть ингибирована. Они имеют малые размеры, облегчающие их эффективную доставку в раковую клетку. Кроме того, иРНК прерывают процесс функционального проявления генов на более ранней стадии, до синтеза белков, количество которых значительно больше, чем матричной РНК. Вследствие этого требуются меньшие количества вводимых в организм больного веществ. Природа иРНК позволяет размножать их с помощью генно-инженерных векторов. Это свойство позволяет создавать и поддерживать в злокачественной клетке необходимую концентрацию терапевтической иРНК вплоть до гибели клетки. В свою очередь, разработанная конструкция вектора позволяет экспрессировать нужную иРНК именно в опухолевой клетке, что минимизирует побочное воздействие на другие органы и ткани организма. Совокупность описанных выше свойств иРНК позволяет создать на их основе новые, более эффективные и обладающие меньшим побочным действием, по сравнению с имеющимися в настоящее время препаратами, противоопухолевые средства.

ПОИСК МИШЕНЕЙ ДЛЯ ИРНК

Общепринятого единого подхода, ориентированного на выявление мишеней иРНК на сегодняшний день не существует. Каждая исследовательская группа разрабатывает и применяет свой собственный подход или поисковый алгоритм. Собственно иРНК, как и другие типы таргетной терапии, могут быть нацелены на одни и те же мишени. Хотя, как показывает практика, применение иРНК против одной мишени существенного успеха не приносит. По анализам наших собственных и зарубежных данных порог клеточной гибели при подавлении экспрессии какого-то одного гена в среднем не превышает 30-40%, в то время как приблизительно столько же клеток гибнет при использовании терапевтических доз стандартной химиотерапии для резистентных клеточных линий. Гораздо более удачным образом выглядит комбинированный нокдаун.

Говоря о наших исследованиях, мы использовали иРНК, направленные на подавление генов, которые в схеме регуляции апоптоза (рис. 1) при раке толстой кишки играют ключевую роль. Объектом исследования служили клетки рака толстой кишки, устойчивые к действию оксалиплатина. Выбранные мишени для иРНК из числа ингибиторов каспаз: FLIP (каспаза 8), cI^P1^ Survivin (каспазы 3, 9). Ингибиторы каспаз блокируют апоптоз (красный контур) и приводят к выживанию клетки (зеленый контур). Апоптотиче-ская гибель клеток в данном эксперименте (рис. 2) в результате ингибирования генов ^ мишеней с помощью иРНК сопоставлялась с уровнем гибели клеток, вызванного обработкой дозой оксалиплатина высокой чувствительности (40мкм). Комбинированное воздействие представляло собой трансфекцию клеток с помощью свободных анти ^ Survivin иPНК и двух экспрессирующихся анти ^ cI^P1 и FLIP иPНК в составе экспрессионных векторов. Инкубация клеток с иPНК проводилась в течение 48 часов, при этом сочетанный нокдаун оказался в два раза более эффективным по сравнению с одиночным ингибированием.

Хорошие результаты дают походы, учитывающие определенный механизм, запускающийся в ответ на специфическую химиотерапию. Примером такого механизма может служить специфическая индукция экспрессии гена Gr^78, под воздействием на клетку ингибиторов гистоновых ацетилаз (Wang J et al, 1999). В отношении Grp78 известно, что он гиперэкспрессирован во многих типах рака и блокирует процесс деградации нативной структуры белков, вызываемый эндоплазматическим стрессом в результате внешних стрессовых воздействий (ультрафиолета, повышения температуры, использования химиоте- рапии, нарушения глюкозного обмена). Спустя 10 лет группа Baumeister et al, 2009, показала, что ингибиторы гистоновых ацетилаз, например, разрешенный к клиническому применению противопухолевый препарат, vorinostat (Zolinza®) также активируют Grp78 в опухолевых клетках. При этом выключение экспрессии данного гена с помощью иРНК совместно с назначением ингибиторов гистоновых ацетилаз демонстрирует синергичный противоопухолевый эффект. Наши собственные исследования по гипертермии на клетках рака толстой кишки, показали троекратное усиление чувствительности клеток к нагреванию при 42 0С при подавлении гена Grp78/HspA5 с использованием иРНК.

Многие исследователи используют комбинацию иРНК на фоне стандартной химиотерапии, используемой в существенно меньших дозировках. В качестве наглядного примера можно привести исследование Longley et al, 2006, в котором авторы ингибировали экспрессию гена FLIP в присутствии малых (1-5 мкм) доз оксалиплатина, циплатина и 5ʼ- флуорацила. Исследования, проводимые нашей группой, также показывают воз- можность преодоления резистентности к химиотерапии посредством малых доз оксалиплатина в комбинации с иРНК. Нокаут гена FLIP в присутствии 10мкм оксалиплатина приводил к 55% апоптотической гибели клеток по сравнению с 12% гибели в присутствии только оксалиплатина. Комбинация анти -Survivin иРНК и векторов экспрессирующих анти - FLIP и cIAPl иРНК в присут-cтвии 10 мкм оксалиплатина увеличивала в 6 раз чувствительность клеток к противоопухолевому препарату (Pис. 3).

В последние несколько лет предпринимались неоднократные попытки масштабированных подходов для анализа генов, экспрессия которых связана с действием химиотерапии. Это в основном работы, выполненные с использованием микрочипов. Однако выяснилось, что полученные данные очень трудно сопоставить между собой, поскольку разными авторами использовались препараты разных концентраций с индукцией апоптоза на разных стадиях.

Так, например, группой Meynard D et al , 2007 был проведен скрининг генов, ассоциированных с оксалиплатином на 6 клеточных линиях рака

Рис. 1. Схема регуляции апоптоза (источник ^p/kegg/pathway/hsa/.

толстой кишки с использованием микрочипа фирмы Клонтек (Atlas Plastic Human 8K Microarray from Clontech). В результате было выявлено 394 гена, экспрессия которых коррелировала с оксалиплатином. Эти гены авторы попытались сопоставить с 254 генами, выявленными в результате подобного исследования, проведенной группой Arango et al,(2004). Авторы проводили микрочи-повый экспрессионный анализ на 30 линиях рака толстой кишки. В результате сопоставления был выявлен 1 совпадающий ген.

Интересно также привести пример масштабной работы Harradine K.A. et al , (2011) с использованием иРНК ^ библиотек. В ходе этой работы проводился поиск генов, выключение работы которых усиливало бы цитотоксичность. Авторы провели сравнительный нокаут 500 генов с использованием иРНК в присутствии разных доз оксалиплатина (1-35 мкм). В результате было выявлено 27 генов, подавление которых приводило к повышению чувствительности опухолевых клеток к оксалиплатину в концентрации 1,5 мкм. В это число входили главным образом гены из семейства репарации ДНК: MCM4 , MBD3 , NHEJ1 , BRIP1 и др., а также TNFR - суперсемейства ( LTBR , lymphotoxin-b receptor, который отвечает за стимуляцию сигнального путͷ ΝF-kB). Хотя показатели усиления чувствительности оказались не очень значительными (не более, чем в два раза), в подобного рода исследованиях эффективность ингибирования зависит от большого количества факторов, включая качество подобранной структуры самих иРНК, подбор способа защиты от де-градаци (Jonathan K et al , 2008), эффективность доставки в клетки, условия культивирования клеток и т.д. Исследования подобного рода оказываются очень трудоемкими, а главное, не совсем

Рис. 2. Апоптоз раковых клеток толстой кишки НТ-29 при одиночном и комбинированном подавлении экспрессии генов ^ мишеней с использованием иРНК. (К) ^ клетки не обработанные оксалиплатином, SCR ^ scrambled, иРНК со случайной последовательностью нуклеотидов.

понятно, каким образом можно использовать полученные данные для выбора потенциальных мишеней для терапии.

Наша группа использовала специальный алгоритм, позволяющий выявить гены, активирующиеся не случайным образом в ответ на воздействие противоопухолевого препарата, а непосредственно связанные с устойчивостью к оксалиплатину при раке толстой кишки. В результате были выявлены два гена. Их комбинированное подавление в присутствии 5 мкм оксалиплатина привело к семикратному увеличению чувствительности клеток к данному химиопрепарату.

НОСИТЕЛИ иРНК

Другим преимуществом иРНК является возможность их экспрессии в составе векторов, что дает возможность сводить к минимуму многократное введение препарата. Вектор, попадая внутрь опухолевой клетки синтезирует иРНК в значительное количество длительное время. Разумеется, подобный вариант «генной терапии» не является абсолютно надежным. Попытки лечить заболевания путем введения терапевтических генов в составе векторов уже неоднократно предпринимались. Наиболее известными являются клинические исследования на пациентах с глиомой, которым вводили векторные конструкции на основе аденовируса, экспрессировавшего фермент вируса герпеса ^ тимидинкиназу. В дальнейшем, при лечении с использованием ганцикловира, содержащие данную конструкцию клетки погибали в результате превращения ганцикловира посредством тимидинкина-зы в токсичное соединение, которое блокирует транскрипцию ДНК (Chen SH etal , 1994; Goodman et al , 1996; Germano I.M. et al , 2003). Основным недостатком подобных векторов является побочная цитотоксичность, связанная с попаданием вектора в нормальные клетки. Для преодоления подобных эффектов постоянно разрабатываются современные вектора, обладающие свойствами избирательной доставки и специфичной экспрессии в клетках опухоли.

С развитием биотехнологии в качестве альтернативы вирусным конструкциям постепенно приходят наноносители на основе липосом. Наиболее часто оболочка таких носителей создается с использованием ПЭГ (полиэтилен гликоля). Гидрофильность ПЭГ создает водное микроокружение возле поверхности наночастиц, тем самым снижая степень опсонизации и последующее распознавание мононуклеарными клетками фагоцитарной системы, что значительно продлевает период существования частиц в кровотоке (Gomes-da-Silva LC et al, 2012). В мировой практике уже имеется опыт использования липосом-ных наночастиц для ингибирования экспрессии гена Bcl2 с использованием иРНК (Santos A.O. et al, 2010).

В этой работе авторы использовали наночастицы на основе СеrC₁₆^PEG₂₀₀₀ (полиэтилен гликоля и церамидных остатков, для снижения реакции IgМ и IgG на ПЭГ). С целью достижения большей специфичности также используют наночастицы с поверхностным антителом для взаимодействия с опухолевыми антигенами. Подобный подход был, в частности, успешно использован группой Di Paolo D. et al , (2011), которые использовали ПЭГ ^ наночастицы с антителом (иммунолипосомы) против GD₂ (disialoganglioside, специфически экспрессирующийся в опухолях нейроэктодермального происхождения). Эти наночастицы служили носителями иРНК против гена АLK в клетках нейробластомы. Как показала практика, иммунный ответ на ПЭГ в ряде случаев оказывается весьма существенным, что снижает эффективность подавления мишени. Для преодоления этой реакции используют иРНК доставку на основе менее иммуногенных носителей, например ПЭИ (полиэтилениминов) (Günther M et al , 2011).

В последнее время появляются работы, демонстрирующие возможность комбинированного воздействия химиотерапевтических препаратов в малых дозах, помещенных внутрь мицелл совместно с иРНК, прикрепленными к их поверхности (Zhu C et al , 2010; Su WP et al , 2012). Так, например, в работe Hsu C-Y. et al , (2011) описы-вaeтся достаточно простой способ изготовлeния кополимepa полиэтилeʜ гликоль ^ поликапролактон ^ полиэтилeʜeмина с инкапсулировани-eм пpeпарата паклитакceла и прикpeплeниeм к повepxʜocти мицeллы иРНК к гeʜy MDR-1 . Ис-слeдования проводились на клeтках рака лeгко-

Pис. 3. Усиление чувствительности клеток к малым дозам оксалиплатина в результате иРНК ^ нокдауна в различных комбинациях. Κ ^ клетки не обработанные оксалиплатином, SCR ^ scrambled иPHК.

го MCF-7/ADR, устойчивых к доксорубицину. При этом ʜe было выявлeно цитотоксичности при трансфeкции клeток данным кополимeром, при совмeсном ввeдeнии с паклитакceлом он в два раза увeличивал цитотоксиность послeдʜeго.

В настоящeй работe в качecтвe cpeдств доставки иРНК использованы в основном липосомы, как наиболee совepшeʜʜый ʜa ceгодняшний дeʜь носитeль. Однако нашeй группe в тeчeниe послeдних двух лeт работы удалось получить экспpeссионный вeктор, направлeʜʜый на по-давлeниe гeнов мишeʜeй, который содepжит ткaʜecпeцифичный промотор, что приводит к eго избиратeльной экспpeссии в опухолeвых клeтках. Подавлeниe таргeтного гeнa с использо-ваниeм данного промотора в 10 раз пpeвышaeт подавлeниe того жe гeнa в присутствии стандартного H1 промотора, использующeгося во многих коммepчecких вeкторах.

ЗАКЛЮЧEHͶE

B peɜyльтатe соврeмeʜʜых пpeдставлeний об онкогeʜeɜe открываются новыe возможности тepaпии злокачecтвeʜʜых опухолeй. Интepфeри-рующиe PHК остаются интpecʜым направлeниeм избиратeльного выключeния ключeвых гeнов-мишeʜeй в опухолeвой клeткe. В настоящий мо-мeʜт покa eщe остаются ʜeясными пepcпeктивы использования иРНК в качecтвe противоопухолe-вой тepaпии. Есть надeжда, что новeйшиe био-тeхнологичecкиe peшeния с использованиeм иРНК могут в значитeльной стeпeни усилить чув-ствитeльность опухолeй к классичecким цитостатикам и рeшить проблeму лeкарствeнной устойчивости.