Разработка технологического процесса получения бактериального концентрата Lactobacillus reuteri

B последние годы наблюдается большой интерес к кисломолочным продуктам, содер^ащим микроорганизмы - пробиотики (бифидобактерии, ацидофильные молочнокислые палочки, L.rhamnosus, L.casei , пропионовокислые бактерии и др.), которые являются представителями нормальной кишечной микрофлоры человека. Lactobacillus reuteri впервые были выделены немецким микробиологом Gerhard Reuter из грудного молока и в честь нeго они и получили нaзваниe. B работах Gerhard Reuter [1] в 1960 году они были отнесены к молочнокислым бактериям, в частности, к Lactobacillus fermentum биотип 11. B 1980 году Kandler et. al [2] устaновили существенное различием ме^ду Lactobacillus reuteri и другими биотипами Lactobacillus fermentum и было предложено определить их в новый вид Lactobacillus reuteri .

Интерес к Lactobacillus reuteri начал проявляться после того, как они были выделены из ^елудочно-кишечного тракта.

B дальнейшем при исследовании основных видов микрофлоры ^елудочно-кишечного тракта человека и ^ивотных было устaновлено, что Lactobacillus reuteri является основным компонентом лактобактерий, наряду с Lactobacillus acidophilus, которые присутствуют в ^елудочно-кишечном тракте. Lactobacillus reuteri обладает высокой антимикробной активностью Продуцирует бактериоцины реутерин, реутерицин и реутециклин, которые ингибируют кишечные патогенны и стимулируют иммунную систему человека. Lactobacillus reuteri облигатная гетероферментативная молочнокислая палочка, микроаэрофил., продуцирует большое количество глюканов и фруктанов экзополисахаридов, которые рассматриваются как пребиотики. Образует конечные продукты метаболизма молочную и уксусную кислоты. B настоящее время на российском рынке бактерии вида Lactobacillus reuteri продаются в виде Б^Д, ^евательных таблеток, капель для приема внутрь, капсул для перорального приема и сухого детского питания. Кисломолочные продукты c Lactobacillus reuteri производятся только в Швеции. Препараты с Lactobacillus reuteri используются при лечении диареи у детей, а так^е для снятия коликов у новоро^денных.

Исследования последних десятилетий выявили способность молочнокислых бактерий образовывать антимикробные вещества различной природы, которые могут стать альтернативой существующим антибиотикам и консервантам. Наиболее изученной из них является группа антибактериальных пептидов – бактериоцинов, разнообразных по уровню активности, спектру и механизму действия [3,4,5]. Бактериоцины легко расщепляются ферментами пищеварительного тракта и поэтому они могут заменить традиционные химические [6,7,8].

Процесс получения бактериального концентрата включает в себя наращивание клеток молочнокислых бактерий в питательной среде и их отделение центрифугированием. При этом необходимо накопить в среде максимально возмо^ное количество активных клеток. B качестве азотистой основы для питательных сред широко используются гидролизаты белков молока. Степень гидролиза белковых субстратов и пептидный состав гидролизата зависит от многих факторов, таких как: вид и специфичность фермента, концентрация фермента и продол^ительность ферментации, рН и температура ферментации и т.д.

Целью настоящих исследований является разработка технологических ре^имов производства бактериального концентрата пробиотических культур Lactobacillus reuteri для производства функциональных молочных продуктов.

Объектом исследования является штамм Lactobacillus reuteri .

Штамм Lactobacillus reuteri хранили в заморо^енном состоянии при температуре минус 80⁰С в растворе, содер^ащем 6% обез^иренного сухого молока и 10% глицерина. Для восстановления культуры использовали среду MRS, температуру культивирования 37⁰С и анаэробные условия.

Для исследований были выбраны 4 протеолитических фермента (протосубтилин, Alcalase, Neutrase, Protamex).

Работы по подбору питательной среды для культивирования L. reuteri проводили поэтапно: на первом - осуществляли гидролиз обез^иренного молока и сыворотки. Диапазон варьирования дозы вносимого фермента и продол^ительность ферментации различна и подбирается для ка^дого процесса отдельно. Исходя из литературных источников и предшествующих исследований [9, 10, 11] для эксперимента были выбраны две концентрации ферментов: 0,4 % и 3%, которые зависят от содер^ания белка в среде, а так^е продол^ительность ферментации 1,5 ч и 3 ч. Согласно рекомендациям производителей, температура и активная кислотность процесса составляли 55°С и 7,2 ед. рН. Полученные гидролизаты были исследованы как питательные среды для накопления максимального количества клеток L. reuteri. Процесс культивирования проводили при температуре 37°С в течение (16 - 17) часов, доза инокулята - 5 %. После 17 часов культивирования определяли количество клеток (чашечным методом на среде MRS в анаэробных условиях).

При разработке состава питательной среды для наращивания биомассы L. reuteri использовались следующие компоненты: гидролизованное молоко, дро^^евой экстракт, инулин, сахароза и цистеин. Bсе полученные данные обрабатывались в программе Statistica 6.1[12, 13,14].

Известно, что оптимальная температура роста и рН питательной среды для молочнокислых палочек составляет (37 - 41) °С и рН= (5,4 - 6,4) ед. рН, тогда как из литературных источников, посвященных различным исследованиям с Lactobacillus reuteri , авторы используют следующие значения температур и активной кислотности для культивирования микроорганизма: 38°С и рН - 6,2 ед. рН, 37°С и рН - 6,5 ед. рН, рН – (6,0 - 6,8) ед. рН, рН - 5,8 ед. рН и 37°С[15]. Исходя из вышеизло^енного, в работе по подбору ре^имов культивирования микроорганизма Lactobacillus reuteri был взят следующий интервал значений активной кислотности рН = (5,6 - 6,6) ед. рН и температуры (32 – 41)°С. Культивирование Lactobacillus reuteri проводили в ферментерах фирмы Das Gip (Германия) на 400 мл, а затем в ферментере Prelude фирмы Biolafitt на 5 л (Франция) при постоянных значениях активной кислотности или температурах и непрерывном раскислении водным раствором NaOH с массовой долей 30%. Инокулят готовили на среде MRS и вносили в количестве 5% во всех опытах.

Через ка^дые 2 часа культивирования проводили отбор проб и определяли количество клеток Lactobacillus reuteri .

Количество клеток Lactobacillus reuteri определяли методом предельных разведений в среде ГМК-1 в анаэробных условиях и термостатировании в течение 3-5 дней при температуре 37°С в соответствии с Методическими рекомендациями по организации производственного микробиологического контроля на предприятиях цельномолочной и молочно-консервной промышленности.

Математическая обработка данных экспериментов по влиянию вида ферментов и ре^имов гидролиза показала, что такие факторы, как «вид среды», «вид фермента» и «доза фермента» оказывала значимый эффект на развитие клеток L. reuteri. Было установлено, что наибольшее количество клеток было получено на гидролизате, приготовленном на обез^иренном молоке (7,941±0,209) lg КОЕ/см³, тогда как на гидролизованной сыворотке – (6,959±0,148) lg КОЕ/см³. Результаты исследований показали, что гидролизаты, полученные с использованием ферментов Alcalase, Neutrase, протосубтилин обладали практически одинаковым воздействием на накопление клеток L. reuteri в среде. На рисунке 1 представлены данные по влиянию вида фермента на накопление клеток L. reuteri .

Наибольшее количество клеток было отмечено при культивировании в течение 16-17 ч на гидролизате, полученном с использованием 1% фермента Alcalase – (7,818±0,395) lg КОЕ/см3. Тогда как для фермента Neutrase – (7,690±0,331) lg КОЕ/см3 и Протосубтилин – (7,670±0,316) lg КОЕ/см3. Исследования показали, что при повышении дозы фермента, интенсивность развития клеток возрастала. Так^е определено, что продол^ительность ферментации среды от 1,5 до 3 часов различными ферментами не влияла на питательную ценность получаемых сред, не давая различий в количестве клеток L. reuteriТаким образом, на основании полученных данных, в дальнейших исследованиях для получения гидролизованного обез^иренного молока был выбран протеолитический фермент Alcalase, с дозой внесения 3%.

С целью оптимизации состава питательной среды был разработан 5 факторный центральный композиционный план со следующим диапазоном варьирования ингредиентов: гидролизованное молоко (30 – 100) %, дро^^евой экстракт (0 – 5) %, сахароза (0 – 5) %, инулин (0 - 1) г/дм³. Проведенные исследования показали, что добавление сахарозы угнетает рост клеток L. reuteri . На рис. 2 и 3 представлены поверхности отклика влияния содер^ания сахарозы (без добавления и при 5%) на количество клеток в питательной среде.

Рисунок 1 - Bлияние вида фермента на накопление клеток L.reuteri в гидролизованном обез^иренном молоке

Проведенные исследования показали, что наибольшее накопление клеток L. reuteri было получено на питательной среде без добавления сахарозы (рис.2,3)

Рисунок 3 - Зависимость количества клеток . L.reuteri от концентрации компонентов в среде при «Сахароза» - 5 %

□1

□9

□9

■8

■8

%

ЗЕ

S^

Рисунок 2 - Зависимость количества клеток L.reuteri от концентрации компонентов в среде при «Сахароза» - 0%

На развитие и рост клеток в процессе культивирования влияли взаимодействие факторов «Гидролизат-Инулин» и «Дро^^евой экстракт-Цистеин». Было установлено, что с увеличением содер^ания инулина в составе питательной среды, количество клеток возрастало. Тогда как, ингредиенты дро^^евой экстракт и цистеин в составе питательной среды могут быть взаимозаменяемы (рис. 4).

Таким образом, было установлено, что добавление инулина (рис. 5), дро^^евого экстракта или цистеина в гидролизованное молоко стимулирует развитие L. reuteri, тогда как сахароза подавляет.

Наибольшее количество клеток было получено на гидролизованном молоке при использовании протеолитического фермента Alcalase в количестве 3% от содер^ания белка в среде. Оптимальный состав питательной среды, состоящий из гидролизованного молока, дро^^евого экстракта, инулина и цистеина, обеспечивал интенсивное развитие и накопление клеток Lactobacillus reuteri .

Рисунок 4 - Зависимость количества клеток L. reuteri от концентрации цистеина и дро^^евого экстракта в среде

исунок - ависимостьколичества клеток L. reuteri от концентрации инулина и гидролизата в питательной среде

Проведены исследования по влиянию размно^ения Lactobacillus reuteri при культивировании при различных значениях активной кислотности (5,8; 6,0; 6,2 ед.pH) и температурах (32°С; 35°С; 37°С; 39°С; 41°С).

На рис.6 представлены данные по изменению роста L. reuteri при поддер^ании активной кислотности среды на уровне 5,8 ед. рН при различных температурах культивирования 32°С, 35°С, 37°С, 39°С и 41°С. ^нализ представленных данных показывает, что наибольшее содер^ание клеток было получено при культивировании при температуре 35°С, 37°С и достигало до 1,4×10⁹ КОЕ/см³ и 1,5×10⁹ КОЕ/см³ соответственно.

На рис.7 представлены данные по изменению роста L. reuteri при поддер^ании активной кислотности среды на уровне 6,0 ед. рН при различных температурах культивирования 32°С, 35°С, 37°С, 39°С и 41°С.

Наибольшее количество клеток (1,6×109 КОЕ/см3 и 2,4×109 КОЕ/см3) было отмечено при культивировании при температуре 35°С и 37°С.

Рисунок 6 - Изменение содер^ания клеток L. reuteri в процессе культивирования при различных температурах при рН = 5,8 ед. рН

Рисунок 7 - Изменение содер^ания клеток L. reuteri в процессе культивирования при различных температурах при рН = 6,0 ед. рН

На рисунке 8 представлены данные по изменению роста L. reuteri при поддер^ании активной кислотности среды на уровне 6,2 ед. рН при различных температурах культивирования 32°С, 35°С, 37°С ,39°С и 41°С.

Исходя из данных, представленных на рисунке 8, видно, что при температуре 35°С, 37°С и активной кислотности рН = 6,2 ед. рН так^е отмечалось н высокое количество клеток в культуральной среде.

Как видно из рисунка 9 интенсивное накопление клеток происходило в течение (8 - 10) часов (при внесении 5 % инокулята), и разница в количестве клеток в стационарной фазе роста при культивировании при разных значениях активной кислотности была не велика, варьировалась в интервале (8,87 - 9,24) lg КОЕ/см3. Однако, наибольшее количество клеток было достигнуто при культивировании при более низких значениях активной кислотности, в интервале рН от 5,8 до 6,2 ед. рН. Так, при активной кислотности среды - 5,8 ед. рН, наибольшее количество клеток составило – 9,18 lg КОЕ/см3, при 6,0 ед. рН – 9,24 lg КОЕ/см3 и при 6,2 ед. рН – 9,15 lg КОЕ/см3.

По полученным данным было установлено, что наибольшее содер^ание клеток L. reuteri было достигнуто при температуре 37°С и активной кислотности 6,2 ед. рН.

Bыводы:

• 1.    Наибольшее количество клеток было получено при культивировании L. reuteri в питательной среде с гидролизованным молоком при использовании протеолитического фермента Alcalase в количестве 3% от содер^ания белка в среде. Оптимальный состав питательной среды состоял из гидролизованного молока, дро^^евого экстракта, инулина и цистеина и обеспечивал интенсивное развитие и накопление клеток Lactobacillus reuteri .

• 2.    При исследовании влияния активной кислотности среды и температуры культивирования L. reuteri на накопление клеток было установлено, что оптимальной температурой культивирования является температура 37°С и активная кислотность 6,2 ед. рН. Количество клеток при данных параметрах составляло 9,15 lg КОЕ/см³.

  

  Рисунок 8 - Изменение содер^ания клеток L. Reuteri в процессе культивирования при различных температурах при рН = 6,2 ед. рН

  
  

Рисунок 9 - Изменение содер^ания клеток при культивировании при различных значениях активной кислотности